《眼科新进展》  2019年8期 741-745   出版日期：2019-08-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
醛糖还原酶和晚期糖基化终末产物受体对糖尿病视网膜病变神经元凋亡的影响


        糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最严重也是最常见的眼部并发症，致盲率极高，被普遍认为是四大致盲因素之一［1］。其发病原因复杂，是多因素影响的、多阶段共同作用的病理过程［2-4］。有研究发现，神经元凋亡与DR有密切联系［5］。目前，糖尿病的高血糖通过何种途径导致机体发生DR的机制尚不明确，DR的防治仍是相关研究领域的重要课题。本研究拟通过探讨DR神经元凋亡及醛糖还原酶和晚期糖基化终末产物受体对其的影响，解析DR的具体发病机制，为该病的防治提供理论依据。
1　材料与方法
1.1　动物分组及模型建立
1.1.1　实验动物及分组　选择健康清洁级Wistar大鼠36只，雄性，10周龄，体质量170~230（200±30）g，购自上海中科院实验动物中心。适应性喂养1周后，将大鼠随机分为对照组、模型组、转染组，每组各12只。实验动物的使用遵循ARVO声明。
1.1.2　模型建立方法　转染组和模型组大鼠采用一次性左下腹腔内注射5 mL链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型［6］，对照组注射PBS缓冲液。构建含有晚期糖基化终末产物受体siRNA的质粒（siRNA的设计和质粒的构建均由上海蓝基生物科技有限公司完成），于造模后第2天利用慢病毒转染入转染组大鼠体内。转染操作：按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用说明，将DNA与Lipofectamine2000混匀后室温下静置20 min，将1 mL混合液以鼠尾静脉注射方式共转染293T细胞。
1.2　方法
1.2.1　空腹血糖和大鼠体质量测定　造模后4周、8周、12周，称大鼠体质量后禁食6 h，剪尾取血后采用血糖仪（美国强生公司）测定各组大鼠的空腹血糖。
1.2.2　口服葡萄糖耐量试验　造模后9周，禁食6 h，各组大鼠均使用0.2 g·mL-1·kg-1体质量葡萄糖（华仁药业股份有限公司）灌胃［7］。分别于灌胃后30 min、60 min、90 min、120 min剪尾取血检测血糖。
1.2.3　TUNEL法检测视网膜神经元凋亡情况　按试剂盒说明书（上海碧云天公司）操作，采用TUNEL法检测各组大鼠视网膜神经元凋亡情况。造模后12周，每组随机选取3只大鼠断颈处死，取双眼眼球，采用40 g·L-1多聚甲醛固定1 h后，使用体积分数3%过氧化氢溶液和预冷处理的蛋白酶K（20 mg·L-1，pH为7.4~8.0）处理，然后于37 ℃湿盒dUTP标记2 h。SABC链霉亲和素-过氧化物酶结合，DAB显色。染色后，细胞核呈棕黄色的细胞为凋亡细胞。计算凋亡指数，凋亡指数是指每张TUNEL阳性切片5个阳性细胞数（细胞核中有棕黄色颗粒者）最多的高倍视野（×400）中阳性细胞所占的百分比。
1.2.4　醛糖还原酶的测定　造模后12周，每组随机选取3只大鼠断颈处死。取双眼晶状体，采用KH2PO4-Na2HPO4缓冲液（pH 7.0，含120 mmol ·L-1的Li2SO4；上海碧云天公司）提取醛糖还原酶，荧光分光光度计测定酶活性［8］。
1.2.5　晚期糖基化终末产物受体的测定　造模后12周，每组随机选取3只大鼠断颈处死。取双眼眼球，分离出视网膜组织，离心取上清液，参考文献［9］的方法提取上清液用于晚期糖基化终末产物受体的测定。采用Western blotting法测定晚期糖基化终末产物受体的表达，80 g·L-1分离胶与50 g·L-1浓缩胶进行聚丙烯酰胺电泳后，转移到硝酸纤维膜上，与兔抗大鼠晚期糖基化终末产物受体多克隆抗体（1∶200稀释）和羊抗兔IgG抗体（1∶1000稀释）结合。采用鲁米诺试剂进行发光显色后，确定晚期糖基化终末产物受体相对GAPDH的表达量。
1.2.6　RT-PCR检测视网膜中Bcl-2和Bax的mRNA表达　造模后12周，将每组剩余3只大鼠断颈处死，取双眼眼球，分离出视网膜组织。取80 mg受试大鼠视网膜组织用液氮研碎，加1 mL Trizol制成匀浆。再加入0.2 mL氯仿后混匀，4 ℃ 12 000 r·min-1离心15 min。加0.5 mL异丙醇后，4 ℃12 000 r·min-1离心10 min。弃去上清液，加体积分数75%乙醇清洗一次。真空干燥后，用DEPC处理过的双蒸水溶解沉淀，即得RNA样品。使用反转录试剂盒，以反转录得到的cDNA为模板，加入引物后进行PCR反应。然后采用20 g ·L-1琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析，采用全自动图像分析系统计算每个条带的积分光密度值，计算得到Bcl-2和Bax相对β-actin mRNA的表达量。
1.3　统计学分析　采用SPSS 20.0统计分析软件处理数据，计量资料采用x?±s表示，组间比较采用单因素方差分析或者重复测量的方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料采用百分率（%）表示，组间比较采用χ2分析。检验水准：α=0.05。
2　结果
2.1　各组大鼠体质量　造模前各组大鼠体质量差异无统计学意义（P=4.156）。造模后与造模前相比，各组大鼠体质量均明显增加（均为P<0.05），且造模后8周体质量高于造模后4周（均为P<0.05）。造模后4周和8周，转染组和模型组的大鼠体质量均低于对照组（均为P<0.05），但两组间差异均无统计学意义（均为P>0.05）。造模后12周，转染组和模型组的大鼠体质量均低于对照组（均为P<0.05），且转染组高于模型组（P<0.05）。见表1。



2.2　各组大鼠空腹血糖水平比较　造模后4周、8周、12周，各组内大鼠空腹血糖水平均无明显变化（均为P>0.05）。造模后4周、8周、12周，转染组和模型组大鼠的空腹血糖水平均高于对照组（均为P<0.05），但两组间空腹血糖差异均无统计学意义（均为P>0.05）。见表2。



2.3　口服葡萄糖耐量试验　模型组和转染组大鼠在口服葡萄糖后30 min时，血糖水平均高于对照组，且转染组更高（均为P<0.05）。随着时间推移，模型组和转染组大鼠的血糖水平在120 min时下降至最低，但仍高于对照组（均为P<0.05），且转染组仍高于模型组（P<0.05）。见表3。
2.4　视网膜神经元凋亡情况　模型组大鼠视网膜神经元凋亡指数为（64.85±9.82）%，转染组为（89.37±8.37）%，均高于对照组的（5.02±0.34）%（均为P<0.05），且转染组高于模型组（P<0.05）。
2.5　醛糖还原酶和晚期糖基化终末产物受体测定　模型组和转染组大鼠的醛糖还原酶活性和晚期糖基化终末产物受体均高于对照组（均为P<0.05），且转染组高于模型组（均为P<0.05）。见表4。




2.6　RT-PCR检测Bcl-2和Bax mRNA的表达　模型组和转染组的Bcl-2 mRNA相对表达量均低于对照组（均为P<0.05），且转染组低于模型组（P<0.05）。模型组和转染组的Bax mRNA相对表达量均高于对照组（均为P<0.05），且转染组高于模型组（P<0.05）。见表5。



3　讨论
        一般认为，在高血糖的环境下，氧自由基损伤和晚期糖基化终末产物的形成、积累是影响细胞正常生理功能的重要原因［10］。凋亡相关基因分为凋亡促进基因和凋亡抑制基因两种。其中，Bcl-2是最主要的抑制基因，其可阻止细胞凋亡。Bax是Bcl的同源基因，它的表达可以抑制Bcl-2的保护效应而使细胞趋于凋亡［11］。DR的发病原因复杂，是多因素影响的、多阶段共同作用的病理过程。在高血糖的环境下，通过氧自由基损伤和晚期糖基化终末产物的形成、积累影响细胞的正常生理功能［12］。但是其具体发病机制尚不明确，DR的防治仍是相关领域的重要研究课题。晚期糖基化终末产物是过量的糖和蛋白质结合的产物。研究表明，持续高血糖引起体内多种蛋白质非酶糖基化及由此形成的晚期糖基化终末产物在糖尿病慢性并发症的发病机制中起重要作用［13-14］。
        本研究发现，模型组和转染组大鼠在口服葡萄糖30 min后血糖水平显著高于对照组；模型组和转染组大鼠的血糖水平在120 min时下降至最低，但仍高于对照组。模型组和转染组的视网膜神经元凋亡指数、醛糖还原酶活性、晚期糖基化终末产物受体和Bax mRNA相对表达量均高于对照组，尤其转染组高于模型组；模型组和转染组的Bcl-2 mRNA相对表达量低于对照组，转染组亦低于模型组。以上结果说明，在糖尿病的作用下，长时间的高血糖导致晚期糖基化终末产物的产生，与文献［15］结果一致。晚期糖基化终末产物会直接损伤细胞，引起自由基增加［16］。晚期糖基化终末产物与其受体结合后，也会诱导大量氧化应激，产生过量氧自由基。自由基会破坏细胞线粒体正常结构，干扰其氧化磷酸化功能，抑制了ATP的产生，进而削弱了钙/钠等泵功能，从而引起钙内流［17］。以上损伤导致抑制因子Bcl-2表达量的降低和Bax表达量的升高，进而导致视网膜神经元凋亡，最终导致DR［18］。
        本研究结果表明，晚期糖基化终末产物结合受体后，产生大量的氧自由基损伤可能是导致糖尿病视网膜神经元凋亡，进而导致DR的直接或间接的最后共同通路。该机制的揭示为DR的预防提供了理论依据，有极其重要的意义。