《眼科新进展》  2019年8期 719-722   出版日期：2019-08-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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针刺对干眼的抗炎作用以及与JAK2/STAT3信号转导通路的关系


        干眼是临床常见的眼表疾病，以眼部干涩感、异物感、畏光、眼红、刺痛，视力波动、视疲劳，甚至强烈的不适感等为主要临床表现，严重影响人们的工作与生活。其发病率逐年上升，流行病学调查显示^［1］，干眼发病率为6%~30%。研究表明，炎症是干眼的主要发病机制，干眼会引起眼表面上皮细胞的非感染性炎症反应，眼表炎症反应与干眼患者症状的严重程度呈正相关^［2］。JAK2/STAT3通路是近年来发现的神经免疫调节通路，能够控制机体炎症的发生与发展^［3］。在JAK2/STAT3通路中，炎症刺激信号通过传入迷走神经传输到大脑，激活反射反应后经传出迷走神经传递，迷走神经的分支副交感神经纤维末梢释放乙酰胆碱（acetylcholine，ACh），ACh通过其受体α7nAChR发挥作用，可抑制细胞因子的释放，从而达到减轻炎症的作用^［4］。本次我们拟通过检测干眼模型兔泪腺JAK2/STAT3信号转导通路中相关因子表达变化，探讨针刺对干眼的抗炎作用以及与JAK2/STAT3信号转导通路的关系。
1　材料与方法
1.1　实验材料
1.1.1　仪器及试剂　华佗牌一次性无菌针灸针（苏州医疗器械厂生产，产品批号：140314）；Schirmer试纸（天津晶明新技术开发有限公司，批号：20140505），兔α7nAChR、Ach ELISA试剂盒（南京金益柏生物技术有限公司），α-BGT（Sigma，批号：047K4034，规格5 mg），多功能酶标仪（美国Biotek公司，型号：ELX800），恒温培育箱（上海一恒科学仪器有限公司，型号：GHP-9050N），荧光PCR仪（美国Life公司，型号：Quantsdudio7），氢溴酸东莨菪碱（成都普菲德生物技术有限公司），氟米龙滴眼液（参天制药有限公司，批号：1FM4362）。
1.1.2　PCR引物合成　引物序列依据Gen-Bank公布的序列进行设计，引物设计由上海生工生物工程有限公司负责完成，本实验所用引物序列如下：JAK2：正向：5’-CATCAGTGGTGGCTTCATCC-3’，反向：5’-TGTCAATCTGGCGATTCTGG-3’；STAT3：正向：5’-AAGAGCCAAGGAGACATGCAG-3’，反向：AATGCTTCTCCGCATCTGGT；兔GAPDH：正向：5’-GGCACGGTCAAGGCTGAGAAC-3’，反向：5’-GGTGAAGACGCCAGTGGATTCC-3’。
1.2　实验方法
1.2.1　实验动物和分组　选取42只健康新西兰兔（南京青龙山动物养殖场，许可证号：SCXK-苏2012-0008），雌雄不拘，体质量1.5～2.0 kg，裂隙灯和眼底镜检查眼前节及眼底无异常，Schirmer实验＞10 mm/5 min的动物入组。所有动物饲养于12 h光照/12 h黑暗的环境中，自由摄食和饮水。依据随机数字表法将动物分为7组，空白组、模型组、西药组、针刺组、假针刺组、拮抗组、拮抗加针刺组，每组6只。动物实验经南京中医药大学伦理委员会审查通过，所有操作均按照实验动物保护条例进行。
        空白组不做处理，其余各组动物每天8∶00、11∶00、14∶00和18∶00时皮下注射氢溴酸东莨菪碱，每次2.0 mg^［5-8］（配制成氢溴酸东莨菪碱溶液每次1 mL），连续21 d，各组动物Schirmer实验均值≤5 mm/5 min且角膜染色阳性为制作干眼炎症模型成功。造模成功后，模型组继续给予氢溴酸东莨菪碱注射，直至实验结束。西药组造模成功后开始于每天8∶00、13∶00、18∶00时给予氟米龙滴眼液，双眼滴眼治疗，连续治疗14 d。针刺组于造模成功后开始给予针刺治疗，穴位：睛明、攒竹、丝竹空、太阳穴、瞳子髎。睛明穴针尖向内下方斜刺入皮下3 mm，攒竹穴向下平刺3 mm，太阳穴直刺3 mm，瞳子髎向外平刺3 mm，均不行针，留针15 min。丝竹空透太阳穴，每侧电针正极接丝竹空穴，无关电极接翳风穴。选用WQ1002韩氏电针治疗仪，采用疏密波，频率4 Hz/20 Hz，脉冲宽度0.5 ms，强度1 mA（强度以针刺部位肌肉出现轻微抽动为准），留针15 min，每天1次，同时皮下注射氢溴酸东莨菪碱（同模型组），连续14 d。假针刺组于模型建立成功后，每天在与针刺组相同时间用钝头针点刺相同穴位治疗，不刺入以避免得气，同时皮下注射氢溴酸东莨菪碱（同模型组），连续14 d。拮抗组从皮下注射氢溴酸东莨菪碱21 d后（即第22天干眼实验动物模型制作成功）开始，经兔耳缘静脉注射α-BGT，剂量4.0 μg·kg^-1［9-10］，同时皮下注射氢溴酸东莨菪碱（同模型组），连续14 d。拮抗加针刺组于造模成功后，经实验兔耳缘静脉注射α-BGT，按4.0 μg·kg^-1剂量给药，同时开始进行针刺治疗，针刺方法同上，同时皮下注射氢溴酸东莨菪碱（同模型组），连续14 d。
1.2.2　检测指标　实验前，实验第21天和第35天采用Schirmer实验方法分别检测各组实验兔泪液分泌量；实验第35天用ELISA法检测泪腺中ACh及α7nAChR含量，PCR法检测泪腺中JAK2/STAT3基因表达水平。
1.2.3　Schimer实验方法　泪液检测滤纸条一端折叠放入下睑1/3结膜囊内，5 min后取出滤纸，从折叠处测量其湿润长度。
1.2.4　ELISA实验方法　将兔处死后即刻取出泪腺，用生理盐水冲洗后称质量，在冰浴中充分匀浆，加300 μL生理盐水稀释，离心后取上清液，用ACh试剂盒检测，用酶标仪测定ACh及α7nAChR含量。泪腺中ACh及α7nAChR含量均采用ABC-ELISA法检测，试剂盒由南京金益柏生物科技有限公司提供，实验步骤按试剂盒操作说明进行。
1.2.5　PCR实验方法　取少量组织液氮速冻并存于1.5 mL Eppendorf管中，加入1 mL Trizol试剂，提取总RNA，参照逆转录试剂盒操作逆转录为cDNA，设置反应条件37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，参照说明书进行实时荧光定量PCR反应，扩增条件95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循环40次，同时做熔解曲线，重复3次，Quantsdudio7型荧光PCR仪输出实验结果，结果采用相对定量法计算2^-ΔΔCt，统计RQ值。
1.3　统计学方法　采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，计量资料采用x?±s表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD和Dunett法，以P< 0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　Schirmer I实验结果　泪液分泌量检测结果显示：实验第21天、第35天，模型组、假针刺组和拮抗组与实验前相比，泪液分泌量均显著下降（均为P<0.05）；实验第21天西药组、针刺组和拮抗加针刺组与实验前相比，泪液分泌量均显著下降（均为P<0.05），而实验第35天3组与实验前相比，差异均无统计学意义（均为P>0.05）。实验第21天、第35天，空白组与模型组相比，泪液分泌量升高，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；实验第35天，西药组、针刺组、拮抗加针刺组与模型组相比，泪液分泌量亦升高，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。实验第21天，模型组、西药组、针刺组、假针刺组、拮抗组、拮抗加针刺组与空白组相比，泪液分泌量下降，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；实验第35天，模型组、假针刺组、拮抗组、拮抗加针刺组与空白组相比，泪液分泌量亦下降，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。Schirmer I实验结果说明氢溴酸东莨菪碱造模21 d有效，西药和针刺治疗可增加干眼模型兔的泪液分泌量。见表1。



2.2　各组兔泪腺中α7nAChR和ACh含量　与空白组相比，模型组、假针刺组、拮抗组、拮抗加针刺组干眼模型兔泪腺中α7nAChR含量和ACh含量均显著降低，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与模型组相比，空白组、西药组、针刺组干眼模型兔泪腺中α7nAChR含量和ACh含量均显著升高，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。见表2。



2.3　各组兔泪腺中STAT3、JAK2 mRNA表达情况　与空白组相比，西药组、针刺组兔泪腺中JAK2 mRNA相对表达量显著升高，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；拮抗组、拮抗加针刺组兔泪腺中JAK2 mRNA相对表达量显著降低，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与模型组相比，西药组、针刺组兔泪腺中STAT3 mRNA和JAK2 mRNA相对表达量均显著升高，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；拮抗加针刺组兔泪腺中JAK2 mRNA相对表达量显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3。



3　讨论
        α7nAChR介导的JAK2/STAT3信号转导通路为基础的抗炎途径，在调控炎症的发生发展中起重要作用。因此，本研究中，我们通过分析针刺对α7nAChR受体介导的JAK2/STAT3信号转导通路的影响，试图探讨针刺治疗干眼的疗效机制。通过检测针刺前后泪液分泌量，泪腺中α7nAChR和ACh含量，以及通路相关因子STAT3、JAK2 mRNA表达情况，进一步明确针刺可以调控α7nAChR及其介导的JAK2/STAT3信号通路从而治疗干眼。本研究结果显示：针刺治疗能够激活干眼模型兔JAK2/STAT3信号通路，升高泪腺内JAK2、STAT3 mRNA相对表达量，而应用α7nAChR特异性拮抗剂银环蛇毒阻断后，其表达量降低。从这一点来讲，针刺能够调控α7nAChR及其介导的JAK2/STAT3 信号转导通路，发挥一定的抗炎效果。
        JAK是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶，目前其家族共发现JAK1/JAK2/JAK3/TYK2四个成员，共同构成JAK家族。JAK家族广泛分布于细胞内，其中JAK2广泛参与造血和免疫等系统的细胞信号转导^［11］。STAT家族作为JAK家族下游的底物，该家族由STAT1/STAT2/STAT3/STAT4/STAT5a/STAT5b/STAT6 七个成员组成，STAT3 是脱氧核糖核酸结合蛋白STAT家族之一，可介导IL-12、IL-23 等多种细胞因子的信号转导。临床上JAK2/STAT3抗炎通路已被广泛应用于多种疾病，如消化道疾病、风湿性关节炎、阿尔茨海默病、脓毒血症、心脑缺血损伤等^［12］，但未见应用于干眼炎症的治疗。JAK2/STAT3 信号通路的活化也被认为是机体应激反应的关键影响因素^［13］。α7nAChR在调控炎症因子产生过程中起到关键性作用。α7nAChR的结构和分布特点以及被激动剂激活后胞内发生的信号转导机制决定了JAK2/STAT3调节炎症的高度特异性。已有实验证实干扰了α7nAChR的生成或将α7nAChR敲除后，不管是电刺激还是应用α7nAChR都无法抑制炎症因子的释放 ^［14］，可见α7nAChR在JAK2/STAT3抗炎通路中是不可缺少的分子。因此我们用α7nAChR特异性的拮抗剂银环蛇毒阻断JAK2/STAT3抗炎通路^［15］，进一步证实针刺是否是通过JAK2/STAT3通路产生抗炎作用的。
        本研究发现针刺治疗干眼模型兔后JAK2/STAT3信号通路被激活，泪腺内JAK2、STAT3的 mRNA相对表达量升高，同时应用α7nAChR特异性的拮抗剂银环蛇毒阻断后，其表达量降低，说明α7nAChR及其介导的JAK2/STAT3 信号转导通路在干眼的发展过程中具有重要作用。本实验针刺穴位的选择，是我们多年临床经验的总结，选穴为睛明、攒竹、丝竹空、太阳穴、瞳子髎，以眼周穴位为主，可疏通眼部经络。睛明为足太阳经穴，为五脉之会，是治眼病要穴，可宣泄郁热；攒竹为膀胱经之穴，取之以资调眼部气血，滋阴清热；太阳为经外奇穴，取之治赤眼头痛之功效；瞳子髎为足少阳胆经头面部的第一穴，取之祛风，泄热，明目之功效；丝竹空为手少阳之穴，主目赤肿痛，各穴共奏滋阴清热的功效。
        JAK2/STAT3 信号通路在干眼的作用机制远没有如此简单，本研究仅对JAK2/STAT3 信号通路的激活，以及STAT3、JAK2 mRNA表达情况进行研究，存在一定的不足之处，进一步研究正在筹划中，期待 JAK2/STAT3 信号通路的研究能为针刺治疗干眼提供新的理论依据。