《眼科新进展》
2019年7期
611-614
出版日期：
2019-07-05
ISSN:
1003-5141
CN:
41-1105/R
褪黑素通过Müller细胞保护糖尿病视网膜神经节细胞的机制
糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病严重的并发症之一，是成年人失明的主要原因
［1-2］
。DR发病机制复杂，涉及血管、炎症和神经等多种因素。Müller细胞是视网膜中数量最多的胶质细胞，对于维持视网膜微环境稳态和正常生理功能具有重要作用。糖尿病时视网膜Müller细胞氧化应激反应明显，参与并促进了DR的发展
［3］
。褪黑素具有强大的抗氧化应激作用，本研究拟观察褪黑素对糖尿病视网膜Müller细胞的影响，以了解其在DR防治中的作用。期望本研究能进一步揭示DR的发病机制，为DR的临床治疗提供新思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂
6月龄清洁级SD大鼠54只，雌雄不限，体质量200～230 g，由锦州医科大学实验动物中心提供。褪黑素、链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、谷氨酸标准品（Sigma公司，美国），丙二醛（malondialdehyde，MDA）、还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）及免疫组织化学试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），神经胶质酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）及谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）抗体（Abcam公司，美国），化学发光试剂盒（上海硕嘉生物科技有限公司）。
1.2 动物模型的制备及分组处理
参照文献
［4］
配制溶液，首先以无水乙醇配制10 g·L
-1
的褪黑素溶液，待褪黑素充分溶解后，加入生理盐水10倍稀释，使褪黑素终浓度为1 g·L
-1
。制备pH 4.5、浓度0.1 mol·L
-1
的柠檬酸缓冲液，用于配制2 g·L
-1
的STZ溶液。使用随机数字表法将实验动物分为对照组、糖尿病组和褪黑素治疗组，每组18只，其中糖尿病组和褪黑素治疗组大鼠建立糖尿病模型，具体方法为：大鼠按60 mg·kg
-1
的剂量腹腔注射STZ溶液，48 h后测尾静脉血糖，将血糖浓度大于16.7 mmol·L
-1
作为糖尿病模型建立成功的标准。糖尿病模型建立成功后，褪黑素治疗组腹腔注射褪黑素溶液（10 mg·kg
-1
），对照组和糖尿病组均注射生理盐水稀释的体积分数10%乙醇溶液。给药后自由饮食，3个月后进行以下各指标检测。
1.3 大鼠视网膜MDA与GSH含量检测
每组随机选取6只大鼠乌拉坦麻醉后断颈处死，取双侧眼球，移除眼前节和玻璃体，用移液器吸除眼杯内残余液体。解剖显微镜下分离视网膜，以生理盐水制备5 g·L
-1
组织匀浆，离心取上清，根据试剂盒提供的操作流程和公式测算MDA和GSH的含量。
1.4 大鼠视网膜GFAP免疫组织化学染色
每组随机选取6只大鼠乌拉坦麻醉后断颈处死，取双侧眼球，以40 g·L
-1
多聚甲醛固定2 h，300 g·L
-1
蔗糖溶液中过夜脱水。冰冻切片机沿眼球矢状轴切片，制备厚15 μm视网膜冰冻切片。再依次经H
2
O
2
孵育，正常山羊血清封闭后加入1∶3000稀释的GFAP一抗，4 ℃冰箱中孵育24 h，PBS漂洗后再用A594标记的1∶500稀释的二抗室温下孵育4 h，封片，荧光显微镜下拍照，利用Image J软件检测各组吸光度值（A值）。
1.5 Western blot检测视网膜GFAP和GS的表达
每组随机选取3只大鼠乌拉坦麻醉后断颈处死，摘除眼球，解剖显微镜下剥离视网膜，加入蛋白裂解液制备视网膜组织匀浆，低温离心收集上清液蛋白，水浴使蛋白变性后电泳，转膜，脱脂牛奶4 ℃封闭过夜，分别以GFAP、GS及β-actin一抗室温下孵育 2 h，再以辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，试剂盒显影，凝胶成像系统扫描分析目的条带光密度值。
1.6 高效液相色谱检测视网膜谷氨酸含量
制备乙腈-醋酸缓冲液-乙二胺四乙酸二钠（体积比为 25∶975∶0.25）的流动相A，再制备流动相B，即A相-水-乙腈（体积比为30∶32∶38），梯度洗脱，进样。取100 μL前述实验步骤1.3制备的视网膜组织匀浆，与600 μL无水乙醇充分混匀，离心收集上清，水浴蒸干，以衍生剂复溶，进样，在254 nm下检测，并利用软件system Gold分析校正并通过外标法计算视网膜谷氨酸浓度。
1.7 视网膜切片HE染色
每组取剩余的3只大鼠处死，取视网膜组织制备视网膜切片，将切片贴于载玻片上，苏木精浸染2 min，分化液中浸泡30 s，伊红染色90 s，酒精梯度脱水，二甲苯透明，封片，观察并计数视网膜神经节细胞。
1.8 统计学分析
采用SPSS 20.0统计学软件，所有数值以均数±标准差表示，统计分析采用单因素方差分析，LSD检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 视网膜MDA及GSH含量变化
与对照组相比，糖尿病组视网膜MDA含量增加，GSH含量减少，差异均有统计学意义（均为P<0.01），而褪黑素治疗组与对照组相比MDA、GSH含量差异均无统计学意义（均为P>0.05）。见表1。
2.2 视网膜GFAP免疫组织化学染色结果
免疫组织化学染色结果显示，对照组与褪黑素治疗组GFAP阳性染色主要局限于视网膜神经纤维层，而糖尿病组GFAP阳性染色几乎贯穿视网膜全层（图1）。将对照组A值设定为（100.0±0.0）%，定量分析显示，糖尿病组及褪黑素治疗组A值分别为（356.6±22.8）%和（110.3±9.6）%。与对照组相比，糖尿病组A值增高（P<0.01），褪黑素治疗组A值变化不明显（P>0.05）。
2.3 Western blot检测视网膜GFAP和GS表达变化
与对照组相比，糖尿病组视网膜GFAP表达增加，GS表达显著减少，差异均有统计学意义（均为P<0.01）；褪黑素治疗组与对照组相比差异均无统计学意义（均为P>0.05）。见表1，图2。
2.4 视网膜谷氨酸含量
对照组、糖尿病组及褪黑素治疗组视网膜谷氨酸含量分别为（34.8±5.7）μmol·g
-1
、（44.3±5.2）μmol·g
-1
、（35.6±6.1）μmol·g
-1
。与对照组相比，糖尿病组视网膜谷氨酸含量明显增高（P<0.01）；而褪黑素治疗组与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。
2.5 视网膜神经节细胞计数
各组HE染色结果见图3。对照组、糖尿病组及褪黑素治疗组视网膜神经节细胞密度分别为（1319±351）个·mm
-2
、（886±198）个·mm
-2
、（1126±348）个·mm
-2
。对照组及褪黑素治疗组视网膜神经节细胞排列规则，密度均匀。与对照组相比，糖尿病组视网膜神经节细胞数量减少，密度下降（P<0.01）；而褪黑素治疗组与对照组相比视网膜神经节细胞密度差异无统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
视网膜微血管病变是临床诊治DR的主要参考依据，但DR病理变化不仅局限于微血管病变，还伴有视网膜Müller细胞活化、视网膜神经节细胞凋亡、光感受器异常等变化
［5］
。
糖尿病易导致氧化应激
［4,6］
。GSH具有抗氧化应激能力，而MDA是氧化应激反应的重要产物。本研究发现，糖尿病大鼠视网膜GSH含量减少，MDA含量增加，这表明糖尿病3个月时的视网膜抗氧化应激能力下降，氧化应激产物堆积，发生了氧化应激反应。糖尿病大鼠给予褪黑素后，视网膜GSH含量提高，MDA含量下降，这表明褪黑素能减轻糖尿病视网膜的氧化应激反应。
氧化应激是视网膜Müller细胞结构和功能受损的重要原因之一
［7-8］
。Müller细胞占视网膜胶质细胞的90％以上，几乎贯穿视网膜全层，在维持细胞外环境稳态、维持血-视网膜屏障完整性中发挥重要作用
［9-11］
。GFAP是胶质细胞特有的标志性蛋白，但生理状态下Müller细胞几乎不表达GFAP，病理状态下Müller细胞活化，可见GFAP表达
［11-12］
。本研究观察到，对照组与褪黑素治疗组仅视网膜神经纤维层有少量GFAP蛋白表达，但糖尿病组GFAP表达明显增加，几乎视网膜全层均可见GFAP表达，其范围与Müller细胞空间分布相吻合。这提示褪黑素抑制了糖尿病视网膜的氧化应激反应，减轻了Müller细胞的损伤。
Müller细胞是视网膜中唯一能合成GS的细胞，能利用GS将谷氨酸转化为谷氨酰胺
［13-14］
。谷氨酸是一种重要的神经递质，但过多的谷氨酸堆积能产生细胞毒性，诱导神经元凋亡
［15-16］
。本研究结果显示，糖尿病大鼠Müller细胞GS表达减少，谷氨酸含量增加，视网膜神经节细胞密度降低，可能与Müller细胞清除谷氨酸能力下降，导致谷氨酸堆积，对视网膜神经节细胞产生了毒性作用有关。褪黑素治疗组GS表达增加，可能通过促进谷氨酸转化，降低谷氨酸含量，减轻细胞毒性的机制保护了视网膜神经节细胞，恢复了视网膜神经节细胞密度。视网膜神经节细胞的轴突形成视神经，是传导视觉冲动的主要细胞。因此，我们推测褪黑素在DR防治中有一定作用。
本研究探讨了褪黑素对糖尿病大鼠视网膜氧化应激的抑制作用，进而恢复Müller细胞的功能，增强Müller细胞清除谷氨酸的能力，保护并恢复了视网膜神经节细胞密度。该结果进一步揭示了DR的发病机制，为褪黑素在DR防治中的应用提供了参考依据。