《眼科新进展》  2019年4期 379-384   出版日期：2019-04-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
视网膜感光神经节细胞研究进展


        视网膜感光神经节细胞（intrinsically photosensitive retinal ganglion cells，ipRGCs）是哺乳动物视网膜上一种特殊类型的神经节细胞，是除了视锥细胞和视杆细胞外的第3类感光细胞［1］，它能表达黑视素蛋白（由Opn4基因编码），这是一种在ipRGCs的胞体和树突上均有分布的膜蛋白［2］，因此它具备直接对光产生反应的能力。目前已经鉴定出2种不同亚型的黑视素蛋白［3］，即短（OPN4S）和长（OPN4L）黑视素蛋白，它们仅在C-末端尾部不同，这可能赋予了不同亚型ipRGCs的功能差异。大部分ipRGCs也接受视锥、视杆细胞传递的信号，产生间接对光反应［4］。ipRGCs参与了非成像视觉过程和成像视觉过程的信息传递，包括参与瞳孔光反射、昼夜节律调节、色觉［5-6］和空间感知［7-8］等。随着转基因动物模型和更多标记ipRGCs方法的出现，ipRGCs的细胞分类和中枢投射变得更加清楚，其与多种疾病的关系也更加明确。本文就ipRGCs的细胞分类、信号转导、中枢投射、生理功能以及其在疾病研究中的最新进展进行综述。
1　ipRGCs的分类
1.1　啮齿类　小鼠出生后的早期视网膜发育阶段，ipRGCs可以分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3种亚型［9］，成年后小鼠ipRGCs可以分为至少5种亚型（M1~M5）［10］。区别5种ipRGCs亚型的最明显的特征是树突在内丛状层（inner plexiform layer，IPL）中的分层。不同亚型的ipRGCs的树突在视网膜IPL的分布不同［2］：M1型仅在OFF亚层（IPL的外层，对撤光起反应）中层化；M2仅在ON亚层（IPL的内层，给光兴奋）中层化；M3在ON和OFF亚层中层化；M4和M5型细胞在ON亚层中发现有特别低水平的黑视素蛋白表达和树突。据文献报道，M6型ipRGCs可能存在，它通常也在IPL的2个亚层中分布。M1细胞可能对应于最初的Ⅲ型细胞，M2~M5型细胞对应Ⅱ型细胞，M4型细胞被认为是早期Ⅰ型细胞演变而来［11］。
        ipRGCs亚型可基于树突形态学和细胞类型特异性标记物的免疫染色鉴定。前3种可以用抗黑视素蛋白的抗体免疫细胞化学显现，并具有独特的形态学和生理学特性。此外，5种ipRGCs类型显示出不同的离子电流和电流诱导的尖峰模式［12］，并且M1和M2细胞具有不同的膜静息电位，M1细胞类型具有较高水平的光色素，并且在没有突触输入的情况下，其内在的光敏感性比M2细胞更大［13］，因为其内在光反应阈值较低，幅度较大，且速度快于M2~M5［4］。M3细胞的光反应和膜特性彼此非常相似，并且非常类似于M2细胞［14］。M4和M5细胞不能用传统的免疫细胞化学方法来标记，但具有微弱的内在光反应。M6型ipRGCs有刺状的、浓密的分支状树突，表达极低水平的黑视素蛋白，产生类似M4和M5细胞的弱内在光反应。
1.2　类灵长类　树鼩是昼行性的动物，具有视锥细胞占优势的视网膜和类似于灵长类动物的膝状体- 皮质组织［15］。研究发现其ipRGCs分为3种类型［16］，分别是与啮齿动物和灵长类动物中描述的M1、M2细胞具有形态相似性的细胞，以及一种新的第3种类型的黑视素蛋白免疫阳性细胞。3种ipRGCs的特征分别是：M1样细胞大部分胞体在神经节细胞层（ganglion cell layer，GCL）中，约23％的胞体位于内核层（inner nuclear layer，INL）。然而，与M1细胞不同之处在于，它的树突分布在S1和S5 2个亚层中（INL从眼内玻璃体面开始分为S5~S1 5个亚层）。M2样细胞的树突分布在S5亚层，且其树突分支更小更密集。第3种类型的ipRGCs仅在INL中具有胞体，其树突单层分布在S1亚层中。第3类ipRGCs特别之处在于它能被用于标记多巴胺能无长突细胞的酪氨酸羟化酶标记，表明它是多巴胺能的ipRGCs。
1.3　猕猴和人类　在猕猴和人视网膜中，ipRGCs树突局限于IPL最内侧和最外侧的两层，根据ipRGCs的树突在IPL的内部或外部的分层，鉴别出2种不同ipRGCs，即IPL内层分层的ipRGCs和外层分层的ipRGCs［17］。2种ipRGCs亚型的不同之处在于：首先，2种感光神经节细胞的树突分层不同；其次，在IPL内层分层的ipRGCs的树突分支比外层分层ipRGCs更明显，在IPL内层分层的ipRGCs可能与小鼠M2型细胞ipRGCs类似［18］；最后，灵长类的内层分层细胞有比外层分层细胞更明显更大的胞体，并且这2种类型它们所在视网膜的位置也不同。内层分层细胞的胞体总是位于GCL中，而大部分外层分层细胞的胞体在INL中。
1.4　ipRGCs的数量　有研究发现，从人类视网膜中的细胞计数可估计ipRGCs占所有人的神经节细胞的0.4％［19］。但在另外2项研究中，人类ipRGCs的数量占所有神经节细胞的比例变化由0.8％［20］到1.5％［21］。这种差异是否是由于个体视网膜之间的差异、标记方法的差异，还是两者原因皆有不确定。在猕猴中，ipRGCs细胞密度同样很低，仅占总的神经节细胞的0.2％［18］。
        ipRGCs的数量还会受一些因素的影响。小鼠T-box brain 2（Tbr2）（也称为Eomes）是一种含有T-box的转录因子，Mao等［22］研究显示，黑视素蛋白表达基因（Opn4）仅在Tbr2阳性的视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）中表达。Tbr2会影响ipRGCs形成，ipRGCs缺失Tbr2后，ipRGCs数量会减少。而Tbr2阳性表达的RGCs可以在ipRGCs丧失时激活Opn4表达黑视素蛋白，所以Tbr2阳性的RGCs可以作为ipRGCs的储备，以调节ipRGCs的数量和Opn4的表达水平。
2　ipRGCs与周围细胞的连接及中枢投射
2.1　ipRGCs的周围连接及信号转导　在视网膜早期发育中，ipRGCs与其他包括ipRGCs的RGCs形成广泛的间隙连接网络介导光依赖性功能调节［23］。在光感受器成熟之前，阻断神经活动主要来源胆碱能视网膜会增加ipRGCs的间隙连接网，从而增加光响应细胞的数量。这种间隙连接网的调节是通过视网膜释放的多巴胺来调节的。
        ipRGCs在明视环境下，光的活化主要由黑视素蛋白介导，通过信号级联反应直接响应明亮光刺激，这是ipRGCs的直接光反应；在暗视环境下，ipRGCs主要接受视杆细胞和视锥细胞对光刺激产生的信号输入，产生间接光反应。
        在黑视素蛋白介导的ipRGCs的光反应中，Mure等［24］研究显示，黑视素蛋白的C末端细胞质区域中的Ser/Thr（丝氨酸/苏氨酸）残基簇的磷酸化有助于其失活，这决定了ipRGCs的响应潜伏期和阈值敏感性，而远离磷酸化簇的保守性差的区域抑制磷酸化作用，从而构成独特的延迟失活机制，这2个区域的协同作用能维持对昏暗光线的响应，并允许光刺激随时间而整合，从而产生精确的信号持续时间。G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR）黑视素蛋白是哺乳动物视网膜中ipRGCs的光色素。Sexton等［25］研究显示，G蛋白偶联受体激酶2（G protein-coupled receptor kinase 2，GRK2）使黑视素蛋白磷酸化，并在光照后降低其活性，可能在ipRGCs的光反应中发挥作用。
        目前ipRGCs间接光反射的机制尚不十分清楚，有一种多细胞参与的通路假说被提出，即视杆细胞将信号传递到视杆双极细胞、无长突细胞和视锥双极细胞，其最终刺激ipRGCs。在此通路中，GABA能无长突细胞通过释放神经递质γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），为视杆和视锥双极细胞提供抑制反馈。此外，GABA无长突细胞能接受来自ipRGCs的输入，并且与ipRGCs密切相关［26］。Walker等［27］ 研究显示，小鼠RGC层的GABA无长突细胞和部分神经节细胞中存在一种RdgB2蛋白，RdgB2蛋白缺陷对小鼠在明视下的昼夜节律和瞳孔光反射无影响，但在暗视环境中其昼夜节律与瞳孔光反射均受损。RdgB2并不影响黑视素介导的直接光反射，而是在ipRGCs间接对光反射的细胞回路中发挥作用。
        Vuong等［28］研究显示，M1型ipRGCs与多巴胺（dopamine，DA）无长突细胞和生长激素释放抑制因子（somatotropin release-inhibiting factor，SRIF）无长突细胞在视网膜内形成微电路循环，参与昼夜节律调节和瞳孔光反射等非图像形成功能。它们的相互作用方式是：M1型ipRGCs激发DA无长突细胞，DA无长突细胞反过来又将抑制反馈回M1型ipRGCs，SRIF无长突细胞释放的神经肽生长抑素也抑制M1型ipRGCs的内在光响应。Sheng等［29］研究显示，在大鼠M1型ipRGCs中存在褪黑激素受体亚型MT1和MT2的表达，表明褪黑激素可通过激活MT1/MT2受体直接调节大鼠ipRGCs的活性，这可能与M1型ipRGCs的昼夜节律调节等非成像视觉功能相关。Schroeder等［30］研究显示，黑视素蛋白对M4 ipRGCs的光响应是不必要的，而视杆和视锥细胞信号输入有助于M4细胞的光响应。Stabio等［6］研究显示，在小鼠中，M5型ipRGCs既接受来自9型视锥双极细胞的选择性UV-视蛋白驱动，又接收来自6、7、8型视锥双极细胞混合的视锥细胞的信号输入，这些细胞的激发和抑制均由ON通道驱动。M5型ipRGCs介导的色度对比由中波长视锥细胞驱动的环绕抑制引起，而该环绕抑制由GABA能无长突细胞介导。
2.2　ipRGCs的中枢投射　ipRGCs沿着树突和细胞体弥漫地表达黑视素蛋白的光色素，并将光子捕获转化为尖峰频率变化。这使得ipRGCs可以将环境辐射信号直接传送到更高的大脑中枢［2］。在已报道的2种不同品系的黑视素基因改造小鼠（tau-lacZ和Cre品系）中已经证实，ipRGCs将轴突投射到视交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）、膝状体间小叶（intergeniculate leaflet，IGL）、橄榄顶盖前核 （olivary pretectal nucleus，OPN）、外侧膝状体核（lateral geniculate nucleus，LGv）的腹侧分裂和视前区［31］，具体包括外侧核、视上核周围、下丘脑室旁核、内侧杏仁核、外侧缰核边缘、上丘（superior colliculus，SC）和中脑导水管周围灰质。在猕猴视网膜中，通过含有共定位的CtB和神经递质谷氨酸和垂体腺苷酸环化酶激活肽（pituitary adenylate cyclase activating polypeptide，PACAP）免疫染色，发现双侧视网膜的ipRGCs向中枢投射到SCN、外侧膝状复合体，包括膝状体前核、顶盖橄榄核、视束核、上丘的上臂和上丘［32］。
        此外，生理学、分子生物学和行为学研究已经揭示，哺乳动物中不同的脑区域接受不同ipRGCs亚型投射［2］。小鼠ipRGCs向SCN投射的主要是M1型 （80％）和M2型ipRGCs （20％）［11］；OPN接收来自M1（55％，主要是壳区）和M2型细胞（45％，主要是核心区）的输入；而SC接收来自M1~M5细胞的输入［4］；向外侧膝状体背核（dorsal lateral geniculate nucleus，dLGN）投射的主要是M4型细胞，但其也接受来自其他非M1 ipRGCs的投射，如 M2、M3和M5 ipRGCs［6，11］。M1 ipRGCs可以根据Brn3b的表达分为2个亚群［7］，其中Brn3b阴性M1细胞投射到SCN，而Brn3b阳性M1细胞投射到OPN。M6细胞向OPN和IGL投射。
        在ipRGCs向中枢的信号传递中发现，ipRGCs将收到的信号通过突触末端的PACAP释放到不同的脑区，PACAP和谷氨酸在ipRGCs对各种非图像形成（non-image-forming visual，NIF）视觉行为的调控中具有互补的作用［33］。Li等［34］研究显示，大约10％的向中缝核背侧（dorsal raphe nucleus，DRN）投射的RGC与黑视素蛋白共标记，其中大部分是ipRGCs的M1亚型。参与视网膜-中缝投射的ipRGCs可能有助于持续的光刺激介导的DRN的5-羟色胺释放调节。
3　ipRGCs的生理功能
        ipRGCs的生理功能在不同的发育阶段不同，在小鼠出生后早期视网膜发育中，ipRGCs主要参与负性趋光性和视网膜血管发育等过程［35］。在成年的动物中发现含黑视素的ipRGCs从视网膜投射到动物大脑的区域，包括成像和非成像视觉处理的区域［32］，证明了ipRGCs的生理功能包括成像功能和非成像视觉功能。
        在非成像功能的研究中发现，ipRGCs尤其是M1型对于非成像视觉形成（non-image-forming visual,NIF）反应是必需的，包括昼夜节律、瞳孔光反射、松果体褪黑激素分泌等［28］，同时也影响情绪相关的行为和认知功能［11］。瞳孔对光反射是重要的一种非成像视觉功能。Kofuji等［36］研究显示，通过遗传学方法使小鼠的ipRGCs表达黑视素蛋白的基因（OPN）“沉默”后，小鼠的瞳孔光反射、活动的光调节和运动活动的昼夜节律光抑制严重受损。选择性激活短波长或中波长敏感视锥细胞（S-或M-视锥细胞）会使瞳孔扩张，长波长敏感的视锥细胞（L-视锥细胞）或ipRGCs激活则使瞳孔收缩，而ipRGCs介导的瞳孔收缩的持续时间是受黑视素蛋白的C末端磷酸化影响的［37-38］。此外，瞳孔光反射的收缩幅度受暗适应持续时间的影响，研究发现，在做瞳孔光反射测试之前进行20 min的暗适应可以获得一致且稳定的瞳孔光反射［39］。调节昼夜节律是ipRGCs的另一项重要功能，因为包括人类在内的哺乳动物中，控制24 h节律的主起搏器位于下丘脑的SCN，而向SCN投射的大部分纤维是ipRGCs发出的，M1型ipRGCs的2种褪黑素受体亚型可能也参与昼夜节律调节［29］。ipRGCs除了促进内部昼夜节律与外部环境光- 暗（LD）循环的同步外，也能对外周组织的昼夜节律进行调节［36］，如肾上腺皮质酮分泌的昼夜节律。ipRGCs作为RGC直接投射到大脑中枢，投射到中枢的不同部位发挥不同的生理功能，投射到下丘脑的SCN和间叶小叶［31］，参与同步起搏昼夜节律［40］；投射到OPN，参与调节瞳孔光反射；向中央杏仁核的投射可能是新生儿对光线厌恶反应的直接神经通路［41］；向外侧丘脑核的未定带（zona incerta,ZI）的投射可能是参与调节内脏和感觉功能。
        在成像视觉功能研究中发现，ipRGCs可以为视觉中心提供有关环境光线的信息，并在辐照度编码和亮度辨别中发挥作用，可作为视网膜的辐照度检测器，提供整体照明度的测量并促进视锥细胞在明亮光线条件下的光适应，此外，ipRGCs还有对比度检测和颜色感知等功能［4，11］。研究发现ipRGCs可能在黄色/蓝色的尺度上编码颜色［37-38］；M5细胞向dLGN发送轴突，并因此定位ipRGCs向视觉皮层提供色信号，这使得M5细胞可能具有色度对比功能［6］；Cao等［42］发现变化的黑视素蛋白激活水平会改变色觉通路中的平衡点，表明黑视素蛋白激活对独特白色感知产生影响，现有的外周色觉模型可能需要通过并入黑视素信号来改进。Allen等［8］研究显示，单独的黑视素信号可传达空间信息，补偿视锥细胞传达视觉的高时间频率偏差以及视角方向变化的幅度和频率之间的负相关性，所以认为黑视素增强了早期视觉系统在中等空间尺度上编码图案的能力。Zhao等［4］发现，M2~M5 ipRGCs具有中心环绕组织的感受野，可有检测空间对比度的能力，所有ipRGCs对各种运动速度的反应均非常稳定，M1~M4 ipRGCs能调整适应不同的运动速度，这些细胞发出的对比和运动信息可以被上丘的感觉运动区域用来检测视野中的新物体和运动。
4　ipRGCs在眼科疾病中的研究新进展
4.1　遗传性视神经病变　越来越多的研究表明，与传统的RGC相比，ipRGCs不易受到损害和疾病的影响。遗传性视神经病变是一组伴有明显视神经变性和功能障碍的疾病。这些疾病中最常见的是显性视神经病变或萎缩（Kjers’s disease）和Leber遗传性视神经病变（Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON），这些疾病与线粒体DNA突变有关。线粒体视神经病变包括LHON和显性视神经萎缩（dominant optic atrophy，DOA）。对2例LHON患者和1例DOA患者死后眼睛的组织学检查显示，RGC大量丢失，而含有黑视素的RGC丢失相对较少［21］。Moura等［43］利用瞳孔光反射评估LHON患者的ipRGCs数量，发现ipRGCs被选择性地保留。在一组遗传性视神经病变合并视神经萎缩和视力丧失的患者中观察到瞳孔光反射发生［44］。这些观察结果表明，ipRGCs能够抵抗由线粒体功能障碍引起的视神经变性，并在这些视力严重受损的患者中维持眼睛的非成像功能。
4.2　视网膜退行性变　在视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）的P23H大鼠模型中，在退化性疾病的晚期阶段，含黑视素蛋白的ipRGCs的密度、完整性和树突分支减少［45］，对照组老年期野生型大鼠的ipRGCs数量也减少，但P23H大鼠减少得更多，这种ipRGCs的减少与年龄相关的退行性改变以及RP相关［46］，并且导致昼夜节律的减弱。De Silva等［47］通过腺相关病毒载体将人黑视素蛋白基因（Opn4）导入视网膜变性的rd1小鼠视网膜下，发现13个月后小鼠的瞳孔光反射、避光行为、基本图像识别功能均有所恢复。表明通过视网膜下途径的黑视素蛋白基因治疗可能是用于治疗人类终末期视网膜变性的可行且稳定的治疗选择。国内也有研究将黑视素蛋白基因导入rd1小鼠的双极细胞，在神经节细胞上记录到了明显的来自上游双极细胞的光反应［48］。提示转导黑视素蛋白基因至ON型双极细胞可以有效恢复视网膜退行性变小鼠的视觉功能。在晚期年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）患者中发现，黑视素蛋白介导的光照后瞳孔反应（post-illumination pupil response，PIPR）和睡眠效率之间存在相关性，可能由于ipRGCs功能障碍使视交叉上核和腹外侧视前区的光信号输入减少，使得晚期AMD患者的睡眠效率降低［49］。Yeh等［50］通过对犬进行彩色瞳孔测量发现，通过暗适应下的暗蓝、亮蓝和蓝光背景的亮红光刺激致瞳孔收缩，可分别评估视杆细胞、黑视素介导的ipRGCs和视锥细胞的功能。并且发现在犬迟发性视网膜变性模型中，ipRGCs表达黑视素蛋白的mRNA水平降低，但在非变性视网膜疾病（如色盲）中无明显变化。这些发现使得通过测定ipRGCs光反应来量化视神经损伤成为可能。
4.3　青光眼　Kelbsch等［51］在研究青光眼患者对特定色光刺激的瞳孔光反应时发现，青光眼患者ipRGCs的黑视素驱动途径发生特征性损伤，其突触功能受损，并且外光感受器、RGC、ipRGCs之间的相互作用改变。Obara等［52］研究显示，与年龄相同的对照组相比，严重晚期的青光眼患者的视网膜神经节细胞层ipRGCs密度降低。Gracitelli等［53-54］研究显示，青光眼引起的ipRGCs功能下降会影响瞳孔光反射和睡眠质量，视网膜神经纤维层（retinal nerve fibre layer，RNFL）厚度与瞳孔光反射之间存在相关性，ipRGCs数量的减少可能与RNFL厚度减少有关；患者更容易白天嗜睡，这种嗜睡与瞳孔光反射减弱，尤其是蓝色闪光的持续光反射减弱以及多导睡眠图参数降低相关。Kuze等［55］用视网膜电图（electroretinogram，ERG）记录来自晚期青光眼患者的ipRGCs，与正常受试者相比，其在非潜伏期的幅度显著降低，在潜伏期2组之间无显著差异。在1例青光眼患者的病例研究中，患者的眼睛无光感、RNFL受损，但是观察到轻微的瞳孔光反射［56］，保留一些ipRGCs功能。这些观察表明，ipRGCs能抵抗由线粒体功能障碍引起的视神经变性，并在这些视力严重受损的患者中维持眼睛的非成像功能。患者人体组织学和电生理学研究表明，ipRGCs在青光眼患者中丧失或传递中断，ipRGCs的发现提供了一种潜在的方法来进行青光眼筛查。
4.4　角膜表面损伤　畏光是角膜表面损伤的早期症状，Matynia等［57］研究显示，角膜损伤后的畏光与角膜损伤程度成正比，并且受表达黑视素蛋白的ipRGCs的影响。在缺乏表达黑视素蛋白的ipRGCs的小鼠中观察到角膜机械敏感性和畏光的减弱，表明ipRGCs介导的神经通路参与调节角膜表面损伤的这2种最常见症状。
4.5　其他　Leber先天性黑矇（Leber congenital amaurosis，LCA）是由于作用于外部视网膜的基因突变引起的严重视力丧失。Charng等［58］研究了LCA患者的PLR，发现LCA患者对持续时间短的标准刺激没有可检测到的PLR，对于持续时间较长的刺激，大多数患者可检测到PLR，认为严重LCA患者的PLR可能代表了与视锥和视杆细胞输入无关的的黑视素介导的电路的激活，这种黑视素蛋白介导的PLR可用于定义针对没有外部视网膜功能的患者临床试验中后视网膜传递的保真度。Charng等［58］推出了一种基于LED的五基色光刺激器，可以在恒定的背景光感受器激发水平下控制人体中的视杆细胞，短波长敏感、中波长敏感、长波长敏感的视锥细胞和含有黑视素蛋白的ipRGCs的激发，这使研究人员能够研究ipRGCs组合各种光感受器输入的机制。
        随着人们对ipRGCs的研究越来越深入，对其细胞类型及生理功能认识更加全面，对其在疾病中的认识研究也越来越清楚。作为一类重要的神经节细胞，ipRGCs在眼的视觉成像系统和非成像视觉系统中担任重要角色，在眼科学及神经精神病学等方面也发挥重要作用，如ipRGCs对视觉缺失相关疾病的特异性诊断有重要意义；对ipRGCs表达的黑视素蛋白的研究，使得黑视素基因治疗视网膜退行性变成为可能。随着分子生物学和基因学的发展，对ipRGCs的生理功能及分子机制认识会更加完善，这将为进一步研究相关疾病的发病机制及制订更简单优化的治疗方案提供更加可靠的依据。