《眼科新进展》  2019年2期 113-117   出版日期：2019-02-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
N-乙酰-5-羟色胺对视网膜缺血-再灌注损伤大鼠视网膜 Fas、FasL 蛋白表达的影响


        视网膜缺血-再灌注损伤（retina ischemia-reperfusion injury，RIRI）常见于青光眼、视网膜中央动脉闭塞等多种眼科疾病，可导致视网膜细胞损伤及视网膜功能损害，甚至导致失明。目前临床对RIRI尚缺乏行之有效的治疗方案。因此，寻找RIRI的防治方法已成为眼科研究的热点。细胞凋亡是RIRI的主要发生机制，死亡受体途径是由细胞膜上死亡受体介导的重要凋亡机制，Fas、Fas配体（FasL）蛋白是该途径的核心蛋白，其中，Fas又称为APO-1/CD95，而FasL是一种Ⅱ型蛋白，可以跨膜和分泌，均属肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）受体家族的重要成员［1］。Fas与其配体FasL结合后，激活凋亡通路的Caspase-3（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3），又称死亡蛋白，引起凋亡级联反应，导致细胞凋亡［2］。N-乙酰-5-羟色胺（N-acetylserotonin，NAS）是褪黑素前体物质［3］，具有抗氧化［4］、抗缺血［5］等生物活性作用［6］。我们前期研究发现NAS对大鼠 RIRI 具有神经保护作用，其机制与 NAS 减轻RIRI大鼠神经细胞的凋亡有关［7］，但是 NAS 如何减轻 RIRI 大鼠神经细胞凋亡有待进一步研究。本研究采用高眼压法建立RIRI模型，通过腹腔注射NAS进行干预，探讨 NAS减轻RIRI大鼠视网膜细胞凋亡的作用机制。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验动物及分组　取健康成年 Sprague Dawley 大鼠 54 只，体质量200~250 g，雄性（购自济南朋悦实验动物繁育有限公司并授权使用）。采用随机数字表法将大鼠随机分为正常组（6 只）、RIRI组（24 只）与 NAS组（24 只）；通过高眼压法建立大鼠 RIRI模型，依据造模后不同时间点又分为 6 h、12 h、24 h及72 h四个亚组。NAS组于造模前 30 min 腹腔注射 NAS （5 mg·kg-1），RIRI组腹腔注射等剂量的生理盐水。
1.1.2　主要试剂　NAS （美国 Sigma-Aldrich 公司）；Fas、FasL 抗体（武汉博士德生物试剂有限公司）；抗兔二步法试剂盒、DAB 显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；HE染色试剂盒（碧云天生物技术有限公司）。
1.2　方法
1.2.1　RIRI模型的制作　采用前房加压灌注升高眼压法建立大鼠 RIRI模型。100 g·L-1水合氯醛腹腔注射麻醉，盐酸奥布卡因滴眼液局部麻醉，微量注射器自颞侧角膜缘刺入大鼠右眼前房并固定，升高输液瓶高度至距大鼠眼垂直距离 136 cm，使大鼠眼内形成 100 mmHg （1 kPa = 7.5 mmHg）的眼压，维持灌注时间60 min，可观察到大鼠前房加深，球结膜变白［8］；用直接检眼镜观察发现大鼠眼底苍白，视网膜动脉血流中断，提示 RIRI模型建模成功，灌注完毕拔除针头。
1.2.2　标本的采集、包埋及石蜡切片的制作　RIRI组及 NAS组分别于再灌注后的6 h、12 h、24 h及72 h取右侧眼球，40 g·L-1多聚甲醛固定，水冲洗后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，制成石蜡块。平行于视神经矢状轴且非连续切片，切片厚约4 μm，置于多聚赖氨酸包裹的载玻片上。
1.2.3　HE染色　石蜡切片脱蜡至水，苏木素液染色 5 min，双蒸水冲洗，体积分数 1％ 盐酸酒精分化，双蒸水冲洗，伊红染色至橘红色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在光学显微镜下观察视网膜细胞形态学的变化，计数视网膜神经节细胞数量并测量视网膜的厚度。
1.2.4　免疫组织化学染色　石蜡切片脱蜡至水，抗原热修复，体积分数3％H2O2去离子水37 ℃孵育，阻断内源性过氧化物酶。正常山羊血清封闭后分别加入兔抗Fas单克隆抗体（1∶100）、兔抗FasL单克隆抗体（1∶100），4 ℃ 冰箱过夜；37 ℃复温后30 min，用PBS 冲洗，依次滴加抗兔二抗试剂盒试剂，37 ℃孵育60 min，经PBS 冲洗后，DAB 显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察，计数视网膜神经节细胞层及内核层Fas、FasL 阳性细胞数［9］。
1.3　统计学方法　采用 SPSS 20.0统计学软件进行统计学分析，计量资料均以均数±标准差表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　HE染色结果　正常组大鼠视网膜各层细胞分界清晰，形态正常，神经细胞排列整齐；RIRI组大鼠再灌注后6 h视网膜各层出现水肿，以神经节细胞层及内核层较显著，神经节细胞数较正常组减少；再灌注后12 h视网膜水肿变性明显，神经节细胞数进一步减少；再灌注后24 h视网膜水肿进一步加重，大部分神经节细胞纤维层发生空泡变性，神经节细胞继续减少；再灌注后72 h，视网膜厚度变薄、神经节细胞数达较低水平；NAS组大鼠再灌注后6 h、12 h、24 h 视网膜水肿程度较 RIRI组轻，NAS组再灌注后72 h 视网膜厚度较 RIRI组厚，NAS组各时间点神经节细胞数均较 RIRI组多，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。见图1、表1和表2。





2.2　各组大鼠视网膜Fas蛋白表达的变化　正常组几乎未见Fas+细胞。再灌注后6 h，RIRI组视网膜神经节细胞及内核层开始出现少量Fas+细胞；再灌注后12 h，RIRI组视网膜Fas+细胞表达逐渐增多；再灌注后24 h视网膜Fas+细胞数达到高峰，棕色阳性染色细胞分布在视网膜神经节细胞层、内丛状层、内核层及神经纤维层；再灌注后72 h视网膜Fas+细胞较再灌注后24 h减少。NAS组在再灌注后6 h、12 h、24 h、72 h视网膜Fas+细胞数均较RIRI组各时间点减少，再灌注后24 h，Fas+细胞数达较高水平，随后下降，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。见表3和图2。




2.3　各组大鼠视网膜FasL蛋白表达的变化　正常组视网膜可见 FasL 全层低表达。RIRI组再灌注后 6 h，视网膜神经节细胞层和神经纤维层存在少量 FasL+细胞；再灌注后12 h FasL蛋白表达逐渐增多；再灌注后24 h FasL+细胞数达高峰，可见深棕色的细胞膜及细胞质染色细胞分布在视网膜神经节细胞层、内丛状层、内核层及神经纤维层；再灌注后72 h FasL蛋白的阳性表达逐渐减少。NAS组再灌注后 6 h、12 h、24 h、72 h 视网膜 FasL+细胞数均少于 RIRI组各时间点阳性细胞数，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。见图3和表4。




3　讨论
        视网膜发生缺血再灌注时，常可以导致视网膜细胞凋亡，如果早期给予积极治疗，可以逆转 RIRI，减轻视网膜细胞凋亡，保护受损的视网膜细胞［10］。我们前期研究发现NAS对大鼠RIRI视网膜神经细胞具有神经保护作用，其机制与NAS减轻RIRI大鼠神经细胞的凋亡有关。NAS是褪黑素的直接前体，不仅可自身转化为褪黑素发挥神经保护作用，同时，NAS 本身具有抗氧化、清除氧自由基等功效，故近年来引起人们的广泛关注［11］。本研究采用高眼压法建立大鼠 RIRI模型，发现RIRI模型大鼠视网膜变薄、视网膜神经节细胞数变少，与相关文献报道一致［12］，提示造模成功；而NAS组视网膜厚度较薄，但仍厚于RIRI组，视网膜神经节细胞数较多，显著高于RIRI组，表明 NAS 对RIRI 具有神经保护作用，其机制可能与 NAS 减轻视网膜细胞的凋亡有关［7］，但 NAS 减轻 RIRI 凋亡的机制目前尚不清楚，故本文在此基础上进行深入研究。
        Fas/FasL介导的死亡受体通路是视网膜细胞凋亡最重要的信号通路之一。Fas是I型细胞表面糖蛋白，可通过结合自身天然配体FasL而传递凋亡信号［13］。FasL是Fas配体，FasL由活化的T细胞表达，并可在眼组织中表达，诱导浸润性炎症细胞凋亡或防止新生血管形成，除了促凋亡活性外，FasL 还可以诱导促炎症细胞因子的释放［14］。Fas 与 FasL 结合后，激活 Caspase-3，导致细胞凋亡［15］。本研究发现，正常组视网膜仅见少量 Fas+细胞和FasL+细胞，而再灌注后6 h，RIRI组可见较多Fas+细胞与FasL+细胞，细胞数均增加，再灌注后24 h，Fas+细胞与FasL+细胞数均达到较高水平，再灌注后72 h 维持较高的水平。再灌注后各时间点Fas+细胞与FasL+细胞数均显著高于正常组，提示RIRI 大鼠可促进 Fas、 FasL蛋白的表达，这与相关文献报道一致［16］。再灌注后6 h，NAS组可检测到 Fas+细胞与FasL+细胞；再灌注后24 h，NAS组Fas+细胞与FasL+细胞数均增加，并达到较高水平，随后表达逐渐下调；各时间点NAS组Fas+细胞与FasL+细胞数均显著低于 RIRI组，提示NAS可通过抑制Fas、FasL蛋白的表达发挥神经保护作用。由此推测，NAS可通过抑制 Fas、FasL 蛋白的表达，进而减轻RIRI大鼠视网膜细胞凋亡。