《眼科新进展》  2018年12期 1191-1195   出版日期：2018-12-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
干细胞治疗角膜损伤的研究进展


        角膜是位于眼睛最外面的透明、无血管的结构，直接暴露于环境。它既是主要的屈光间质，又是重要的保护屏障。角膜容易被化学烧伤、热灼伤、机械损伤，以及长期配戴角膜接触镜、泪膜不稳定、感染、其他相关疾病以及屈光手术等因素损伤，损伤后触发的角膜组织愈合多形成瘢痕。因此，角膜损伤的治疗是重要的临床研究课题。角膜缘干细胞移植目前被认为是改善各种病因所致角膜缘干细胞缺乏（limbal stem cell deficiency，LSCD）的症状和功能最有希望的治疗方法。热灼伤及化学性角膜烧伤是移植角膜上皮干细胞（limbal epi-thelial stem cell，LESC）以改善损伤的上皮创伤的主要临床适应证。
1　干细胞在角膜上皮损伤的治疗进展
1.1　自体角膜缘干细胞移植　自体角膜缘干细胞移植（limbal autograft transplantation，LAT）首先由Barraquer在50多年前应用于单侧烧伤患者［1］，而后这一术式被广泛应用，国内外多次报道过该治疗的治疗效果。在Baylis等［2］对角膜烧伤后行LAT的成年患者随访中，发现1 a后治愈或部分治愈率为75%~81%，3 a后约为70%，这充分说明了该种方法仍是临床上治疗LSCD的重要手段之一。
        当需要较大量的自体角膜缘干细胞组织移植时，人们常常担心会对供体眼造成医院性的LSCD。而Busin等［3］通过回顾2005年1月至2014年12月接受LAT治疗的18例患者，并对捐献眼取组织进行细胞体外培养、细胞免疫组织化学染色、组织学参数等多项指标进行对比分析，得出了与目前观点相反的结论。在LAT术后甚至更长的时间，可以从供体眼供体区域再次分离出LESC，并且取材区与对照区分离出的LESC相比表现出相当稳定的生物学特性，其细胞倍增能力、体外细胞传代次数、克隆形成和K12以及黏蛋白1标记物的表达在取材区和对照区获得的细胞中基本相同，首次证明了手术对供体眼睛的无害性。这意味着LAT重复使用来自相同眼睛的可能性，而且扩大了该治疗的适应证。
        Rama等［4］通过临床研究发现，p63标记极有可能是角膜缘干细胞的特殊标记，手术的成功率与具有p63标记细胞的比率有正相关性。当体外培养的细胞中含有的p63标记细胞比例大于3%时，移植的成功率约为78%，反之，移植的成功率仅为11%。这与人类角膜缘含有至少5%的干细胞的发现是一致的。当然，移植的成败也与初始眼部损伤类型和术后的并发症有关。也就是说，保证干细胞百分比是必要的，但不足以确保良好的临床结果。
1.2　同种异体干细胞移植　由于自体角膜缘干细胞移植仍然对于供体存在损伤的风险，进而发展了同种异体干细胞移植技术。哈尔滨医科大学附属第一医院张红教授曾对各种原因所致的12例LSCD的患者行同种异体干细胞移植手术。其中有5例联合了角膜移植手术，5例联合深板层角膜移植术+羊膜移植术，剩下2例仅联合羊膜移植术。这12例患者短期的（≤1个月）术后视力及症状均得到明显改善。但随之而来也出现了新生血管的再次长入、角膜混浊，甚至排斥反应等。其中1例接受了“同种异体干细胞移植+深板层移植术”的患者术后1个月出现了明显的角膜排斥反应及新生血管长入，给予结膜下注射抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）药物及抗排斥药物治疗2个月，角膜植片排斥进展。再次行“深板层移植+羊膜移植”，术后视力及症状显著改善，随访至今。作者所在研究团队通过临床疗效的观察认为：将此方法联合抗VEGF药物+羊膜移植的治疗效果更佳，但由于本临床应用的病例数少，还不足以论证该联合治疗的疗效，今后还需较大的样本量深入研究。
        角膜缘因其特殊的解剖结构：丰富的血管、淋巴管汇集，有密集的朗格汉细胞可以把异体抗原呈递给T细胞，同时干细胞的HLA-Ⅱ类抗原的增强表达。这些均导致角膜缘成为免疫排斥的高危区域。因此，该治疗后的患者需终身应用免疫抑制剂，以预防移植排斥反应［5］。研究表明，在应用了全身免疫抑制剂后，异体角膜缘干细胞移植的5 a存活率仅为50%，甚至不如穿透性角膜移植（penetrating keratoplasty，PKP）的成功率［6］。还有研究表明其存在移植排斥反应而再发生角膜新生血管（corneal neovascularization，CNV）危险，因此，临床上对此方法治疗 CNV仍有很大争议［7］。
1.3　体外扩增干细胞移植　因异体移植的排斥、供体来源短缺问题一直无法避免，于是发展了体外扩增细胞后移植技术。干细胞诱导分化技术与此同时也在不断发展，使得体外扩增的细胞种类也多样起来。为了让这些培养的细胞能更好地移植，研究人员又寻找了不同的生物支架作为移植的载体，下面分别介绍体外扩增的细胞种类及成果，以及生物膜支架的种类及优异性。
1.3.1　体外扩增LAT　Pellegrini团队1997年应用了一种新的方法来治疗LSCD，即移植体外扩增的LESC技术［8］。这种方法现在已成为许多国家治疗LSCD的选择。该治疗包括在纤维蛋白支架上移植扩增的自体角膜缘上皮细胞。临床使用的移植物由干细胞及其后代瞬时扩增细胞（transient amplifying cells，TAC）组成。虽然体外培养形成的移植物中LESC的比例较小，但仍可以替代损伤的角膜缘上皮细胞并重新形成角膜上皮。培养的LESC与角膜缘自体移植相比较，对于严重单侧角膜烧伤的患者术后6个月的效果有着非常相似的成功率。体外培养LESC扩增所需的组织量是最小的，因此该方法是优选的［9］。同种异体LESC培养物移植也已成功应用。更欣喜的是，冷冻保存后扩增的LESC下调表达了组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC），因此丧失了免疫原性，使得免疫排斥反应极少发生［10］。
        最近关于移植LESC的结果也存在争议。在一些研究中，术后3~9个月DNA分析没有发现移植的同种异体细胞，但角膜表面仍然保持稳定［8，11］。在其他临床研究中，移植物在被排斥之前能存活3~8 a，这也证明了移植细胞长时间存活的能力［12］。目前的争议仍需进一步研究，以得到明确结论。
        体外扩增的LESC培养物的缺点包括细胞传播次数的限制，同种异体移植排斥和疾病传播的风险增加。
1.3.2　体外扩增其他细胞移植　许多国家在双侧LSCD中也面临同种异体LESC移植的供体角膜短缺。由此又找到一些与角膜上皮功能相似的替代细胞源，以恢复眼表、促进伤口愈合。这些替代细胞源包括：培养的口腔黏膜上皮、毛囊、脐带内层干细胞，以及来自眼眶脂肪、骨髓或未成熟牙髓的间充质干细胞［13］。
        临床上常使用培养的自体口腔黏膜上皮移植，尽管成功率略低于LESC移植（接近70％），但也是重要的发展方向［14］。
        Yang等［15］分离了小鼠的触须毛囊角化干细胞，将其培养在类似角膜缘特定微环境中，并上调转录因子pax6表达，下调转录因子复合物b-catenin、Lef-1 表达，使毛囊干细胞可分化成角膜上皮样的细胞，由此又寻找到了一种可能的角膜上皮干细胞的替代细胞，但是其对于人体的应用方面还需进一步研究证明。
        脐带内层的间充质干细胞和其上皮细胞均进行过角膜再生能力研究，其中脐带内层上皮细胞显示出了很有希望的结果。Saleh等［16］在脐带内层提出了一个新的细胞系，测试其能否成为角膜上皮干细胞的替代细胞，结果发现这种脐带分离出的干细胞表达了角膜上皮干细胞特异的p63、ABCG2、BMI1和HES1蛋白，然后以羊膜作载体移植到兔LSCD模型中，效果令人振奋。治疗后的兔角膜极少有新生血管和混浊，移植的细胞不但没有出现免疫排斥和瘤变，还能在羊膜上生长良好并分化成类似角膜上皮干细胞。这也成为了十分有发展前景的研究领域。
        Holan等［17］制备了骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞以及角膜上皮干细胞，对其生长、分化和分泌特性进行了比较，对分别移植到角膜碱烧伤的兔模型中，并愈合过程的临床表现、角膜厚度、角膜重新上皮化程度、新生血管程度和抑制局部炎症反应进行了评价，发现骨髓间充质干细胞和角膜上皮干细胞的修复效果十分相近，并且均优于脂肪间充质干细胞的修复效果。由此得出结论，在自体角膜干细胞难以获得时，骨髓间充质干细胞可以作为替代细胞进行治疗［18］。
1.3.3　体外诱导多能干细胞移植　胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）和可诱导多能干细胞（inducible pluripotent stem cell，iPSC）是可再生、容易扩增和储存的，这对干细胞治疗角膜疾病方面十分有吸引力。它们可以针对角膜缘进行分化，但这个过程尚未完全优化。使用恰当的可溶性因子，在特定时间段和合适的培养基对多能干细胞向角膜缘上皮分化有至关重要的作用。在将这些细胞放入临床实践之前，需要解决某些关键问题，例如诱变肿瘤发生的风险、高的培养诱导分化成本和不同ESC或iPSC中分化的能力等。
        有学者体外培养胚胎干细胞，并成功诱导其分化成角膜上皮细胞［19］。但胚胎干细胞分化来的角膜上皮细胞与健康成人自身的上皮细胞还是有差异的，所以还需要更多的动物实验来研究胚胎上皮分化所需的药物及微环境。
        有研究体外培养了iPSC，并在模拟角膜缘干细胞微环境的特殊培养基中成功将其诱导分化成角膜上皮干细胞，这些分化后的细胞表达了角蛋白14、ΔNp63和转运蛋白ABCG2等特殊标记，为iPSC替代角膜上皮干细胞提供了可能［20］。
1.4　细胞移植的生物膜支架　为了在移植过程中更容易处理细胞，将LESC培养在各种生物膜上，再缝合或胶合到受损眼的角膜缘区域，然后细胞随时间移动到裸露区域以愈合伤口。常用的生物膜有羊膜 （human amniotic membrane，HAM）、纤维蛋白膜等。在裸露的HAM上培养细胞，其作用基本上类似于角膜缘上皮基底膜［21］。而且，它还可以为细胞提供良好的促进角膜缘干细胞生态稳定的细胞外基质［22］。HAM还可提供一些无免疫原性和有抗炎作用的生长因子。但是，在使用前需对HAM的传染病原体进行彻底筛查，并在无菌条件下适当储存。
        细胞在纤维蛋白膜上能生长良好，避免了排斥反应，获得方式简便是其最突出的优势，但纤维蛋白膜降解速度快，并且它有阻碍细胞迁移的缺点，这也是在使用它进行LESC移植治疗角膜烧伤伤口时应考虑的问题［23］。
        热敏板上生长的细胞可在室温下分离成片，也就是说能在没有载体的情况下将其移植。Nishida等［24］在临床上尝试使用热敏板承载口腔黏膜细胞来治疗LSCD患者。术后4例患者均在14个月的随访期间保持了角膜的透明度。
        体外培养细胞后移植的技术较为复杂，面临很多关键技术上的问题未能解决；并且对实施该方法的医疗机构要求较高，全面推广困难重重；此外，在移植培养过程中培养的细胞易瘤变，移植物移植入眼的过程中易携带病原体等。
1.5　单纯边缘上皮移植　单纯边缘上皮移植（simple limbal epithelial transplantation，SLET）是由印度Kaliki等［25］于2016年首次报道。SLET是先在患眼患处覆盖一层羊膜，再将提取的小块健侧眼角膜缘组织分成更细小的组织，并用纤维蛋白胶将其散在黏附于已覆盖的羊膜上，最后再覆盖一层羊膜或放置角膜绷带镜。该种方法已应用在多种原因所致的LSCD的治疗上，如眼表鳞状细胞癌的治疗等。Basu等［26］对SLET的患者进行1~4 a的随访，125眼中有95眼成功重建了健康的眼表。SLET的临床疗效取得了良好的效果，并且这种治疗的手术成本较低，不存在排斥反应，不会给供体眼带来医源性的损伤。因此，SLET有着广阔的发展前景。
2　干细胞在角膜基质损伤中的应用
        人角膜缘基质含有表达祖细胞标志物Pax6和ABCG2的细胞，它们可以通过成纤维细胞生长因子-2在体外诱导分化为角膜细胞。这些细胞还表达了间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）的标志物，可以在特殊培养基中分化成非角化细胞谱系［27］。研究发现，人角膜缘的这种基质干细胞是多能的，符合国际细胞治疗协会所制定的MSC治疗标准［28］。最近，与之十分相似的MSC已经从人类中心角膜基质分离出来［29］。此外，表达CD133标记的单核祖细胞有分化成角膜细胞的能力［30］。
        在动物角膜创伤模型中，向角膜中注入角膜缘活检来源的人类基质干细胞，可有效防止角膜纤维瘢痕化形成，并促进角膜基质ECM的正常再生，其再生的结构类似于未受伤角膜。这些基质细胞抑制中性粒细胞迁移到受伤基质中，并抑制组织纤维的沉积［31］。
        除了角膜基质干细胞外，其他MSC也能显著降低碱烧伤模型中基质新生血管的形成，降低角膜不透明度和损伤后的炎症反应［32］。
        总之，在角膜损伤的动物实验研究中，角膜基质干细胞和其他MSC似乎成为一种有潜力的治疗角膜烧伤的工具，它能减轻基质纤维化和不透明度。这些实验数据为未来的临床试验打下基础。
3　干细胞在角膜内皮损伤中的应用
        角膜内皮细胞（corneal endothelial cells，CEC）主要通过迁移和扩大来封闭伤口，而细胞增殖是次要的。人类CEC几乎不能在体内或体外扩增。人类CEC的存在也尚未得到确定。在角膜周边观察到慢循环内皮细胞和高核细胞比例的小细胞。它们表达了干细胞标记Oct3/4、Wnt-1、Pax6和Sox2，并且端粒酶活性很高［33］。因此，它们被假定为在伤口愈合过程中能够增殖和扩张的内皮祖细胞。
        目前的研究着重于应用其他干细胞来增强角膜内皮的修复和愈合。有研究报道脐带血中分离出的MSC从体外移植到损伤的内皮层中，并获得内皮表型［34］。CEC由神经嵴干细胞分化而来，在角膜内皮细胞缺陷的大鼠模型中报道了啮齿动物神经嵴干细胞在移植并覆盖Descemet膜后分化成了功能性的CEC样细胞［35］。在动物内皮损伤模型的体内体外实验中，ROCK抑制剂对内皮细胞的增殖迁移也有促进作用。这表明其潜在的治疗用途［36］。ESC以及iPSC也可能成为内皮细胞的重要替代来源，有实验证明由ESC衍生出的功能性CEC样细胞在移植到具有CEC功能障碍的兔眼中后，其角膜恢复透明［37］。这些衍生细胞具有CEC标记AQP1、Na1-K1-ATPase、VⅢ型胶原和ZO-1的高表达，以及与CEC类似的基因谱［38］。
        以上为治疗角膜内皮损伤提供了新的思路，为角膜内皮病变的治疗带来了新的希望。
4　结论
        LSCD的治疗手段越来越多，并且越来越针对于病因进行治疗。从1964年首次提出眼表取材治疗LCSD到目前各种干细胞的治疗方法，在LSCD的治疗上的确取得了相当多的成就和进步。但干细胞移植技术中仍然存在很多无法解释的问题，还有很多问题等待我们进一步研究及验证。要解决这些问题就要继续完善对角膜干细胞的认知程度，了解准确的特征，掌握完善的损伤修复，以及各种参与成分的相互作用机制。ESC和iPSC是很有发展前景的研究方向。而新兴的单纯上皮移植技术虽然在临床上取得了可喜的成绩，但是缺乏基础方面的研究，未来还需进一步深入探究。