《眼科新进展》  2018年12期 1109-1113   出版日期：2018-12-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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密蒙花方防护糖尿病大鼠早期视网膜神经细胞损伤机制探讨


        糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）最为常见和最为严重的眼部并发症之一，占目前世界上双眼盲病因的第一位。长期以来，视网膜微血管病变被认为是诊断DR的金标准，然而，临床中发现许多DM患者在眼底检查未发现DR时已出现视觉对比敏感度、色觉和视网膜电图振荡电位的异常，这些功能异常提示DR在出现微血管病变之前，即存在视网膜神经细胞的损害^［1］。越来越多的研究表明，DM可导致包括视网膜神经节细胞 （retinal ganglion cells，RGCs）在内的几乎所有类型的视网膜神经细胞发生结构和功能的改变，这一认识对于如何早期防治DR具有重要意义。本课题组总结多年临床经验，提出“心肾论治 DR”的新思路，并在此指导下创立密蒙花方治疗早期DR取得良好疗效。现通过在体动物实验，从谷氨酸水平和Sigma-1R表达变化方面探讨密蒙花方防治 DR 早期视网膜神经损伤的作用机制。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验动物　采用清洁级雄性Sprague-Dawley （SD）大鼠120只，约8周龄，体质量200～260 g，购自北京维通利华实验技术有限公司（实验动物使用许可证号：SYXK京2006-0012），饲养于北京中医药大学动物实验室。饲养条件：室温18~25 ℃，空气流通，相对湿度55%~70%，12 h光照维持，昼夜循环，实验期间各组大鼠自由摄食和饮水，不给予胰岛素或其他任何降糖药物。
1.1.2　药品制备　密蒙花方煎剂：中药材购自北京燕北药材公司并经我院药房鉴定。生黄芪20 g，女贞子10 g，益母草10 g，黄连6 g，肉桂2 g，密蒙花10 g，沸水浴煎30 min，过滤并收集滤液，取滤渣重复提取一次，合并二次滤液。水浴锅中定容（临床等效剂量）。
1.1.3　主要试剂　细胞凋亡检测试剂盒（瑞士Roche公司），LSAB通用试剂盒（美国Dako公司），即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、DAB显色剂（美国Sigma公司）；Trizol（美国Invitrogen公司），M-MLV逆转录酶、dNTP（10 mmol·L^-1）、2 Ex TaqMix（DL2000相对分子质量标准；大连宝生物工程有限公司），DNase I、RNase抑制剂（加拿大Fermentas MBI公司），琼脂糖（西班牙Biowest公司）；RNase-free H₂O（韩国Walgene公司），Eva_green（美国Biotium公司），PITC（英国Alpha Aesar 公司）。
1.1.4　主要仪器　旋转型自动脱水机、石蜡包埋机、轮转切片机、光学显微镜（德国Leica）；数码照相装置（日本OLYMPUS）；Image system（EUV-LDUV）凝胶成像系统（韩国Korean Biotech公司）；Chromo4荧光定量PCR仪（美国BIO-RAD公司）；Waters2695高效液相色谱仪、Waters 2998 PDA检测器、Waters Empower Pro 数据处理软件系统（美国Waters公司）。
1.2　方法
1.2.1　分组及给药　实验共分3组，分别为正常组30只大鼠，模型组及密蒙花方组各45只。正常组始终不给药、不灌胃，模型组用与密蒙花方组等容的蒸馏水灌胃；密蒙花方组用相当于临床用药量10倍的中药煎剂灌胃。模型组及密蒙花方组注射STZ 3 d后开始灌胃，每日2次，连续给药3个月。
1.2.2　动物造模　模型组及密蒙花方组造模。动物适应性喂养1周后，禁食12 h，将STZ溶于0.1 mmol·L^-1、pH=4.6的柠檬酸盐缓冲液中，浓度为20 g·L^-1，按55 mg·kg^-1体质量立即行左下腹腔注射建立DM动物模型，正常对照组30只仅以等量0.1 mmol·L^-1、pH=4.6的柠檬酸盐缓冲液腹腔注射。3 d后所有动物禁食8 h以上，断尾取血，测定血糖，将空腹血糖≥16.7 mmol·L^-1者视为DM造模成功大鼠。
1.2.3　一般状况观察　观察大鼠精神状态、饮食及体质量变化，每月肉眼观察白内障的有无及程度。分别于给药1个月、2个月、3个月后水合氯醛 7 mL·kg^-1 体质量腹内注射麻醉，腹主动脉取血，检测血糖。
1.2.4　TUNEL法检测密蒙花方对早期DM大鼠RGCs凋亡的影响　给药1个月后，每组随机取4只大鼠处死，快速摘除眼球，分离视网膜，每只鼠右眼固定于40 g·L^-1多聚甲醛溶液内48 h以上，置体积分数50%~100%梯度酒精各30 min脱水后，进行全层石蜡包埋，切片机切片，厚约4 μm。切片置 50 ℃ 烤箱6 h脱蜡，梯度酒精水化；流水漂洗5 min，PBS洗2次，每次5 min；H₂O₂氧化15 min，流水漂洗5 min，PBS洗2次，每次5 min；加入含体积分数0.1%Triton X-100的枸橼酸钠溶液，置于4 ℃ 2 min，PBS洗2次，每次5 min；加TUNEL反应混合溶液标记样本，湿盒37 ℃孵育60 min，PBS洗5 min；加入POD液37 ℃孵育60 min，PBS洗3次，每次5 min；加入50 μL DAB底物溶液，室温孵育30 min，PBS洗2次，每次5 min；梯度酒精逐级脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。
1.2.5　高效液相色谱法检测视网膜中谷氨酸含量　样本的制备：分别于给药1个月、2个月、3个月后每组随机取6只大鼠处死，立即摘除眼球，取一眼快速剥离视网膜称质量后放入4 ℃ 500 μL的0.1 mol·L^-1高氯酸溶液中，4 ℃下电动匀浆器匀浆，离心半径8 cm，4 ℃ 12 000 r·min^-1离心20 min，取上清液100 μL，4 ℃ 12 000 r·min^-1离心20 min，取上清液备用。
        柱前衍生：谷氨酸根据其溶解度的不同，用甲醇配成贮备液。将27 mg的邻苯二甲醛和40 μL的2-巯基乙醇溶于5 mL的甲醇中，再加入0.1 mol·L^-1的四硼酸钠缓冲液（pH=9.6）5 mL制得的衍生液，室温下密封、避光保存。取20 μL标准浓度的氨基酸液或生物样品，加入上述衍生液10 μL，轻轻混匀，静置120 min，进样20 μL。
        色谱条件：Phenomenex Luna C18色谱柱（250.0 mm × 4.6 mm，5 μm），柱温为43 ℃。流动相A 为0.1 mol·L^-1醋酸钠缓冲液（使用醋酸调整pH为6.5）-乙腈（93∶7），梯度洗脱，流速1 mL·min^-1。检测波长254 nm。
1.2.6　PCR法检测Sigma-1R mRNA水平的变化　给药3个月后每组随机取4只大鼠处死，每只鼠随机取一眼视网膜组织，迅速转移至预冷的RNAiso Plus 试剂中匀浆，常规提取组织总RNA，待RNA 沉淀完全，加适量无RNA 酶的无菌水溶解后于-80 ℃保存。酶标仪紫外分光光度计鉴定RNA 纯度。Prime Script RT reagent Kit进行基因组DNA 的除去反应、逆转录反应。按PCR反应体系进行扩增和检测。引物由北京擎科生物工程有限公司合成，β-actin：正向：5’-GAAGTGTGACGTTGACATCCG-3’，反向：5’-GCCTAGAAGCATTTGCGGTG-3’，长度282 bp；Sigma-1R：正向：5’-GGACGATACTGGGCTGAGATTT-3’，反向：5’-GCCAGGGTAGACGGAATAACAC-3’，长度209 bp。
1.2.7　Western blot法检测 Sigma-1R蛋白水平的变化　取1.2.6处死大鼠的另一眼视网膜，每份组织加 100 μL含蛋白裂解液作用15 min，沸水煮5 min以变性蛋白，离心5 min。将离心后的上清分装至0.5 mL离心管中，测蛋白浓度，测完后放于-20 ℃保存。制作标准曲线，检测样品蛋白含量，每个样品总蛋白上50 μg，浓缩胶80 V，分离胶120 V，进行电泳，转膜约45 min，4 ℃封闭过夜，一抗37 ℃孵育2 h，再以辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，试剂盒显影。
1.3　统计学方法　应用SPSS 13.0统计学软件分析数据，两两比较行两样本均数比较的t检验（Independent-Samples T Test），多组比较行单因素方差分析（One-Way ANOVA），计数资料多组比较采用多个独立样本非参数检验（K Independent Sample Test）。以P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　DM大鼠成模率及死亡率　90只大鼠成模率为100%，整个实验过程中，正常组大鼠无死亡，成模后大鼠死亡率约占成模大鼠的26%。
2.2　一般状况观察　正常组大鼠每日饮水量少，尿量少，皮毛光滑、柔顺、干燥且有光泽；体质量随周龄增大而稳步增长。随着周龄增大，模型组大鼠出现典型的多饮、多食、多尿、消瘦的“三多一少”症状，并伴有体毛枯黄杂乱，背部尤其是靠近尾部的体毛潮湿，不能保持干燥状态，腹部膨隆，尾部变黑溃烂，大便稀溏，有严重异臭味等；体质量较正常组明显减轻。密蒙花方组大鼠精神状态、皮毛光泽度均较模型组改善。各组大鼠体质量详见表1。



2.3　TUNEL法检测密蒙花方对早期DM大鼠RGCs凋亡的影响　TUNEL法标记的凋亡细胞判定：以细胞核呈棕黄（褐）色染色为阳性细胞。与正常组相比，模型组大鼠RGCs数目减少，视网膜内层变薄，RGCs肿胀；密蒙花方组与模型组比较，RGCs凋亡数目减少（图1）。



2.4　高效液相色谱法检测密蒙花方对DM大鼠视网膜中谷氨酸含量的影响　高效液相色谱法检测结果示，给药后1个月、2个月、3个月模型组谷氨酸含量均较正常组增加（均为P＜0.01），密蒙花方组谷氨酸含量均较模型组显著降低（均为P＜0.01）。正常组饲养2个月时谷氨酸含量达到最高，随后降低，而模型组与密蒙花方组随时间延长谷氨酸含量呈逐渐上升趋势。见表2。



2.5　密蒙花方对DM大鼠视网膜Sigma-1R mRNA表达的影响　给药3个月后，正常组、模型组和密蒙花方组视网膜Sigma-1R mRNA相对表达量分别为1.71±0.11、0.67±0.09和1.50±0.14。与正常组相比，模型组Sigma-1R mRNA表达降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，密蒙花方组Sigma-1R mRNA表达升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；密蒙花方组Sigma-1R mRNA表达仍低于正常组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。
2.6　Western blot法检测DM大鼠视网膜Sigma-1R蛋白水平　Western blot检测结果示，正常组、模型组和密蒙花方组视网膜Sigma-1R蛋白相对表达量分别为0.39±0.02、0.16±0.02和0.30±0.01。与正常组相比，模型组Sigma-1R蛋白表达降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，密蒙花方组Sigma-1R蛋白表达升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；密蒙花方组Sigma-1R蛋白表达低于正常组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。



3　讨论
        以往DR研究重点在于微血管，近年研究表明，DR 神经损伤发生在微血管病变之前，重视对视网膜神经细胞的保护对于早期 DR 的防治意义重大。长期以来，中医药在DR的防治过程中发挥着不可忽视的作用。密蒙花方是我院高健生研究员治疗早期DR多年临床验证有效的方剂。密蒙花方是在密蒙花、交泰丸（黄连、肉桂）的基础上加黄芪、女贞子、益母草等药而成。诸药相配，具有益气养阴、和血明目的作用。前期临床研究显示，密蒙花方能够有效改善早期DR患者视力、视野及电生理，提示其对早期DR具有一定的防治作用^［2-4］，但其具体作用机制并不清楚。
        DR早期视网膜损伤可表现为：视网膜内层RGCs数目减少，星形胶质细胞萎缩，Müller细胞反应性增生，胶质纤维酸性蛋白表达升高等。RGCs损害的主要途径是RGCs轴突轴浆运输阻断导致神经营养因子缺乏，造成RGCs的原发性损伤，同时产生较多的兴奋性毒素作用于RGCs的表面受体，出现大量钙离子内流，通过胞内信号转导，激发一系列级联式反应，激活了某些诱导凋亡的基因，最终导致细胞凋亡，进一步引起RGCs的继发性损害^［5］。
        谷氨酸作为视网膜光感受器、双极细胞和RGCs的主要神经递质，介导视网膜神经细胞间的信息传递，行使重要的生理功能。谷氨酸功能的正常行使有赖于RGCs对谷氨酸释放量的严格调控^［6］。过量或超时作用都会导致兴奋性毒性作用而触发神经细胞损伤级联反应，被认为是神经元损伤或死亡的最后通路。研究表明^［7］，DM早期视网膜中谷氨酸含量明显增多，积聚的谷氨酸过度激活其相应受体，最终使RGCs受损；另外，RGCs对于谷氨酸的改变相对较敏感，即使是低剂量的谷氨酸增高对于RGCs也是有害的，故及时清除多余的谷氨酸对维持视网膜内环境稳定和保护RGCs免受谷氨酸兴奋性神经毒性损害具有重要意义。可见，如何防止或减轻DR发生发展过程中RGCs的谷氨酸损伤应为DR研究中不可忽视的一部分。
        Sigma受体曾被视为阿片类受体的一个亚型，主要功能有：控制多巴胺及乙酰胆碱的合成及释放，调控N-甲基-D-天冬氨酸 （Nmethyl-D-asparticacid，NMDA）类谷氨酸受体的电生理学，调控NMDA刺激神经递质的释放，调控毒蝇碱受体刺激磷酸肌酯的转换，神经保护作用，调控痛觉等。有研究表明，Sigma激动剂可降低眼压，对视网膜有一定的保护作用^［8-9］。有研究提出，Sigma-1R与GRP78结合后被激活参与内质网应激^［10］。Ellis等^［11］报道，Sigma-1R的激活或过度表达对于维护RGCs线粒体功能具有重要作用。Sigma-1R操控对神经元兴奋性的调节和钙稳态的调节，此外，Sigma-1R也有助于调节蛋白质降解，降低氧化应激^［12］。
        以往有研究证实，密蒙花方能够在一定程度上减轻STZ性DM大鼠视网膜及视网膜毛细血管的病理改变，其改善大鼠视网膜及视网膜毛细血管病理改变的作用与减少视网膜细胞间黏附分子-1和内皮细胞选择素（E-selectin）表达有关^［13］。密蒙花方能够下调血管内皮细胞内VEGF、VEGFR2 mRNA表达，上调细胞内Flt-1 mRNA表达，干预细胞内VEGF-VEGFR 信号转导通路，是密蒙花方抑制缺氧状态下人脐静脉血管内皮细胞增殖的作用机制之一^［14］。本研究结果显示，DM模型组大鼠RGCs数目减少，密蒙花方组RGCs凋亡数目较模型组减少；早期DM大鼠视网膜谷氨酸含量明显上升，而密蒙花方组谷氨酸含量较模型组降低，提示密蒙花方能减轻谷氨酸的兴奋性毒性作用对RGCs的损伤，从而起到了保护RGCs的作用。本研究发现，DM模型组Sigma-1R蛋白水平降低，密蒙花方组与DM模型组相比，Sigma-1R蛋白水平升高，提示密蒙花方能通过调节Sigma-1R参与保护RGCs的作用，其如何通过内质网途径发挥作用有待进一步研究。