《眼科新进展》  2018年11期 1005-1009   出版日期：2018-11-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
缓激肽对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导视网膜色素上皮细胞发生上皮间充质转化的影响


        增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是增生型糖尿病视网膜病变、孔源性视网膜脱离、眼穿孔伤和眼内手术等的严重并发症，其基本病理生理过程是血-视网膜屏障破坏。PVR的主要病理生理机制是通过上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)将视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞转化为间充质细胞［1］。转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β)在PVR的发病机制中起到至关重要的作用，TGF-β诱导的EMT已经在大部分上皮类型细胞中得到验证［2］。研究发现，在PVR患者玻璃体中和PVR实验模型中，TGF-β的表达和PVR的严重程度呈正相关［3］，阻断TGF-β信号通路可以抑制体内外RPE细胞发生EMT［4-5］。Yu 等［6］研究发现，补体和凝血级联是PVR病理过程中最重要的KEGG通路。而这个级联由激肽释放酶-激肽系统（kallikerin-kinin system，KKS）、凝血系统和补体系统三部分组成，其中KKS主要由激肽释放酶、激肽原、激肽、缓激肽1受体及缓激肽2受体（bradykinin 1 receptor，B1R/bradykinin 2 receptor，B2R）和激肽酶等组成。激肽主要有缓激肽（bradykinin，BK）、胰激肽（kallidin，KD）等，KD在酶的作用下可以转化为BK。生理条件下KKS最终发挥效应的血管活性物质BK主要是激肽类物质，BK在严重PVR大鼠视网膜中的表达明显增加［7］，因此推测KKS通过效应分子BK作用，调节KKS、凝血系统和补体系统，最终通过KEGG通路引发PVR。本研究拟通过观察BK对TGF-β1诱导的RPE细胞EMT的作用，进一步揭示PVR的发病机制，阐明BK对PVR的作用，为临床治疗PVR提供新的靶点。
1　材料与方法
1.1　实验材料　ARPE-19细胞（iCell Bioscience公司），DMEM-H培养液和胎牛血清（Gibco公司），倒置显微镜（OLYMPUS IX70），酶标仪(BioTek公司)，CCK-8细胞增殖试剂盒（上海锐赛生物），E-钙黏素抗体（GeneTex 公司），BK、HOE-140、GAPDH抗体（Sigma公司），α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗体、Viminten抗体、Smad7抗体、pSmad3抗体（Bioworld公司），Transwell小室（Corning公司）。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养　取出冻存的ARPE-19细胞，37 ℃水浴，快速摇晃，直至冻存液完全融化，移入15 mL离心管，1000 r·min-1离心5 min，吸出冻存液，缓慢加入5 mL完全培养液，用培养液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，置于含体积分数5%CO2、37 ℃细胞培养箱中培养。每2 d按1∶2的比例进行传代，隔天换液。于倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。
1.2.2　CCK-8检测ARPE-19细胞的增殖　将对数生长期的细胞消化计数，细胞悬液以每孔5000个（100 μL）的密度铺入96孔板中。待细胞融合至约50%更换无血清DMEM/H培养液饥饿12 h后给予不同浓度的TGF-β1（0 μg·L-1、0.1 μg·L-1、0.5 μg·L-1、2.5 μg·L-1、10.0 μg·L-1、12.5 μg·L-1）刺激细胞，分别作用24 h、48 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续将培养板在培养箱内孵育4 h。酶标仪测定450 nm下的吸光度值（A值），实验重复3次取均值。
1.2.3　细胞形态学观察　将ARPE-19细胞以每孔500×103个接种于6孔培养板，置于37 ℃、含体积分数5%CO2细胞培养箱中培养。待细胞融合至50%~70%加无血清DMEM/H培养液饥饿12 h。将实验对象分为6组，分别为DMEM/H培养液（对照组）、BK组（100 nmol·L-1 BK）、TGF-β1组（10 μg·L-1 TGF-β1）、TGF-β1+BK组（10 μg·L-1 TGF-β1+100 nmol·L-1 BK）、TGF-β1+HOE140组（10 μg·L-1 TGF-β1+10 μmol·L-1 HOE140）和TGF-β1+BK+HOE140组（10 μg·L-1 TGF-β1+100 nmol·L-1 BK+10 μmol·L-1HOE140）。加药顺序为HOE-140加入1 h后加入BK，BK加入0.5 h后给予TGF-β1处理。按组别分别给予不同药物刺激细胞，48 h后于倒置显微镜下观察并拍照。
1.2.4　Western blot分析　取不同组别的ARPE-19细胞加入蛋白裂解液，30 min后离心(12 000 r·min-1离心15 min)，酶标仪定量后电泳分离，再转入硝酸纤维素膜，室温封闭 1 h。分别加入一抗(兔抗E-钙黏素抗体、小鼠抗α-SMA抗体和Viminten抗体，1∶1000)湿盒内 4 ℃过夜，加入二抗，37 ℃下孵育1 h，PBST室温摇床上洗3次，每次10 min，上机扫描，观察结果。所有实验重复3次。
1.2.5　细胞免疫荧光分析　取不同组别的ARPE-19细胞，40 g·L-1多聚甲醛4 ℃固定，PBS 漂洗，50 g·L-1 BSA室温封闭30 min，分别加入一抗(兔抗E-钙黏素抗体、小鼠抗α-SMA抗体和Viminten抗体)，37 ℃孵育1 h，4 ℃冰箱中过夜。PBS洗3遍，孵育二抗2 h，PBS洗3遍，染核(DAPI，1∶200)，体积分数10%甘油封片后共聚焦显微镜下观察，实验重复3次。
1.2.6　细胞划痕实验　用marker笔在6孔板背后用直尺比着均匀划横线，每隔0.5~1.0 cm划一道，横穿过孔。每孔划5条线。用枪头比着直尺，垂至于六孔板背后的横线划痕。用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，于倒置显微镜下观察并拍照，做好记录。将细胞放入37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱培养，24 h后再次于倒置显微镜下观察拍照。利用Image J软件测量每孔多个点划痕间距，24 h时测量的划痕间距减去处理前的划痕间距即为24 h细胞迁移距离。实验重复3次。
1.2.7　Transwell细胞迁移实验　将小室放入培养板中，上室加入300 μL预温的无血清培养基，室温下静置15~30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。调整细胞密度为109个·L-1，取细胞悬液200 μL加入Transwell上室，取500 μL含体积分数5%FBS的培养基加入Transwell下室，置37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱中培养18 h后进行结果统计。实验重复3次。
1.3　统计学方法　采用SPSS 19.0软件进行分析，数据采用均数±标准差表示，组间均数比较采用单因素方差分析。所有数据均为3次实验后取得的平均值。P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　EMT体外细胞模型建立　不同浓度TGF-β1分别作用于ARPE-19细胞24 h、48 h后，A值较对照组（0 μg·L-1 TGF-β1）有所提高，当TGF-β1为0.1 μg·L-1、0.5 μg·L-1、2.5 μg·L-1、10.0 μg·L-1、12.5 μg·L-1时，作用24 h、48 h差异均有统计学意义。48 h时，细胞增殖较24 h时更明显，且当TGF-β1浓度为10.0 μg·L-1时，细胞增殖最明显。用10.0 μg·L-1 TGF-β1处理ARPE-19细胞48 h后，ARPE-19细胞形态发生了明显改变，细胞形态逐渐从典型的鹅卵石样转变为长梭形的间充质样细胞。此外还发现不同浓度TGF-β1刺激48 h后，E-钙黏素表达量较对照组明显减少（P<0.05），且随着TGF-β1浓度的增加，E-钙黏素表达量逐渐减少(图1)。所以，用10.0 μg·L-1 TGF-β1处理ARPE-19细胞48 h可以成功诱导EMT体外细胞模型。
2.2　BK对TGF-β1诱导ARPE-19细胞发生EMT的影响　BK+TGF-β1组可阻止TGF-β1诱导的EMT，长梭形的间充质细胞数量明显减少。而BK+TGF-β1+HOE-140组则减弱了BK的作用，细胞的间充质样转化明显增强。Western blot分析显示，与TGF-β1组相比，BK+TGF-β1组E-钙黏素蛋白表达升高，α-SMA和Viminten蛋白表达降低(P<0.05)。与BK+TGF-β1组相比，加入BK前预敷HOE-140，然后给予TGF-β1刺激，BK作用减弱，α-SMA和Viminten表达量增加(P<0.05；见图2)。免疫荧光结果显示(图3)，BK可以阻止TGF-β1的作用，使E-钙黏素表达增加，α-SMA和Viminten表达下降；而加入BK前预敷HOE-140，然后给予TGF-β1刺激，BK作用减弱，E-钙黏素表达下降，α-SMA和Viminten表达增加。此外，在BK+TGF-β1组中BK可抑制TGF-β1增强的ARPE-19细胞迁移，而BK+TGF-β1+HOE-140组的细胞迁移能力较BK+TGF-β1组增强(图4)。结果提示，BK可以逆转TGF-β1的作用，阻止TGF-β1诱导的ARPE-19细胞发生EMT。






2.3　BK对EMT信号通路下游因子的影响　Western blot结果分析显示（图5)，与TGF-β1组相比，BK+TGF-β1组pSmad3表达减少（P<0.001），Smad7表达升高。与BK+TGF-β组相比，BK+TGF-β1+HOE-140组则逆转pSmad 3和Smad 7的表达水平。结果表明，BK通过TGF-β/Smad通路下调pSmad3表达、上调Smad7表达，从而逆转TGF-β1诱导产生的EMT。



3　讨论
        PVR通常被认为是由RPE细胞中的EMT驱动的纤维化过程，引起视网膜的牵引并导致手术失败［8］。EMT广泛发生于肾间质纤维化中［9］和肝纤维症［10］患者。在哺乳动物中，TGF可分为3种亚型：TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，TGF-β1是介导肿瘤细胞转化的主要细胞因子。TGF-β1诱导的RPE细胞的EMT模型是公认的研究EMT潜在机制的经典模型［11-12］，然而TGF-β1处理的最佳浓度和时间可能有所不同［13-14］。本研究用不同浓度的TGF-β1处理ARPE-19细胞24 h和48 h，观察到10.0 μg·L-1 TGF-β1可导致ARPE-19细胞的EMT。TGF-β1处理48 h后，细胞形态发生明显变化，与24 h相比差异更大。这一结果与Yang等［14］的结果一致。细胞接触完整性是TGF-β1诱导的上皮-肌成纤维细胞转化的重要调节因子［15］。而E-钙黏素是细胞间黏附连接的主要成分，提示E-钙黏素可能参与TGF-β1诱导的EMT。E-钙黏素在正常的ARPE-19细胞中有高表达［16］，当E-钙黏素的转录受到抑制时，它可能影响上皮细胞之间的黏附并最终导致EMT。因此，E-钙黏素的减少是上皮细胞EMT的一个标志。本研究采用Western blot检测发现，随着TGF-β1浓度的增加，E-钙黏素蛋白的表达水平逐渐降低。结果表明，TGF-β1诱导的EMT细胞模型在体外可以成功建立。
        目前尚无安全有效的临床药物作为PVR的常规治疗方法［17］，抗炎治疗可能是PVR的一个潜在研究方向。补体和凝血级联是PVR病理过程中最重要的KEGG通路，KKS是连接补体通路和凝血通路的中间过程［15］，在炎症中起着重要作用。在KKS系统中，血浆激酶将高相对分子质量的激肽原转化为BK和赖氨酸缓激肽，而组织激酶则在酶的作用下将低相对分子质量的激肽原转化为赖氨酸缓激肽，转化为BK。BK氨基酸序列为Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg，其通过自分泌-旁分泌机制释放，与组织器官中的激肽受体结合后发挥一系列复杂的生理效应［18］。BK受体分为B1R和B2R，BK介导的生物学反应主要是与B2R作用产生的。B2R由多种细胞类型表达，包括心肌细胞、疼痛敏感的神经元、血管内皮细胞、平滑肌细胞等［19］。为探讨BK对PVR是否有类似作用，本研究采用BK刺激体外细胞模型，观察BK对PVR模型的影响。结果表明，BK对TGF-β1诱导的EMT蛋白表达水平有影响，并可逆转EMT。为了进一步确定BK是否影响TGF-β1诱导的EMT迁移，本研究采用细胞划痕愈合实验和Transwell细胞迁移实验，结果表明，BK可抑制ARPE-19细胞的迁移。加入HOE-140，细胞迁移能力增强。
        在RPE细胞发生EMT的过程中，TGF-β/Smad通路是主要的作用途径［20］。TGF-β结合在跨膜的TGF-βⅡ型受体TGFR2上，然后与TGF-βⅠ型受体TGFR1形成紧密连接的复合体，导致Smad2和Smad3磷酸化激活，并与Smad4形成三聚体，转运到细胞核，进一步调控TGF-β反应基因的转录［21］。尽管这一过程中pSmad2和pSamd3的功能都被肯定，但近期研究发现，TGF-β主要的靶基因都是pSmad3依赖的转录调控，没有Smad3的激活，TGF-β将不会诱导RPE细胞发生EMT［22］。在EMT相关的晶状体损伤模型和PVR模型中，敲除小鼠Smad3基因可以有效地抑制上皮细胞发生间充质转化［23］。抑制性的Smad蛋白Smad7可以负向调控Smad2/3，其过表达将抑制RPE细胞发生EMT［24］。上调BK-B2R通路可调节TGF-β/Smad信号级联，减少肾纤维化［23］。然而，BK在RPE细胞中的作用尚不清楚。在本研究中，BK降低了pSmad3的表达水平，提高了Smad7的表达水平，防护性改变被HOE-140逆转。然而，目前的结果仅在体外得到验证，是否在体内观察到同样的结论还需要进一步研究。
        本研究结果提示，BK通过TGF-β/Smad信号通路参与了TGF-β1介导的ARPE-19细胞的EMT进程。这些发现可能会为未来预防或治疗PVR提供一种临床治疗策略。