《眼科新进展》  2018年10期 968-971   出版日期：2018-10-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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我国原发性青光眼患者外周血中含缬酪肽蛋白和α-胞衬蛋白含量的研究


        青光眼是一组进行性视神经损伤病变，共同特征为缓慢的进行性视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）及轴突的丢失，从而导致视盘形态的改变并伴随视野的缺损^［1］。国内外学者普遍认为导致RGCs死亡的最大危险因素是眼压的升高。现有研究表明，药物和手术治疗可以显著降低眼压^［2-3］，但临床研究发现，眼压的下降并不能完全阻止RGCs的丢失^［4］。有研究显示，青光眼与自身免疫反应有关^［5-8］。本试验通过对比原发性闭角型青光眼（primary angle-closure glaucoma，PACG）患者、原发性开角型青光眼（primary open angle glaucoma，POAG）患者与正常人外周血中含缬酪肽蛋白（valosin-containing protein，VCP）和α-胞衬蛋白（α-fodrin）含量的异同，以期寻找我国青光眼的免疫学指标，为青光眼的诊断和治疗提供依据。
1　资料与方法
1.1　一般资料　选择自2015年1月至2017年9月首诊于我院和郑州大学第一附属医院眼科的青光眼患者，入组前均未经治疗，青光眼诊断标准参照《我国原发性青光眼诊断和治疗专家共识（2014年）》。PACG组：患者40例，年龄（53.85±20.26）岁，男22例、女18例，纳入标准：有一眼原发房角部分或全部关闭，并有急性病史或慢性眼压升高，伴有视盘损害和视野缺损。POAG组：患者40例，年龄（55.76±21.15）岁，男19例、女21例；纳入标准：24 h眼压峰值超过21 mmHg（1 kPa=7.5 mmHg），伴有视盘损害和（或）视野缺损，房角开放。对照组：40例，均来自于同期我院健康体检者，年龄（54.86±21.78）岁，男17例、女23例，未合并任何眼病。PACG组、POAG组及对照组患者均排除眼部外伤史及手术史，排除眼部免疫相关疾病如葡萄膜炎、干燥综合征，排除全身免疫系统疾病和自身免疫性疾病如甲亢、系统性红斑狼疮、1型糖尿病等。本研究获得郑州大学医学伦理委员会的批准，患者知情同意。
1.2　药品及器材　人VCP的ELISA检测试剂盒由武汉CUSABIO公司提供，α-fodrin的ELISA检测试剂盒由武汉Elabscience公司提供，生化培养箱由上海三发科学仪器有限公司提供（型号：SHP-160FE），酶标仪由美国BIO-RAD公司提供（型号：i-MARK），低速离心机由安徽中科中佳仪器有限公司提供（型号：SC-3610），超纯水器由美国Merck Millipore公司提供（型号：MILLI-Q）。
1.3　方法
1.3.1　血清的获取　在临床确诊为青光眼后未行手术和药物治疗前，抽取所有患者和对照组人群清晨空腹静脉血3 mL，4000 r·min^-1离心10 min，取血清放入Eppendorf管，于-80 ℃冰箱内冻存备用。
1.3.2　ELISA法测定血清中VCP、α-fodrin的含量　按照试剂盒说明书操作顺序分别测定血清中VCP、α-fodrin的吸光度值（A值），使用BIO-RAD酶标仪检测。
1.4　统计学方法　采用SPSS 23.0统计学软件进行处理，计量资料以x?±s表示，组间均数经Bartlett检验证实方差齐。采用单因素方差分析对比PACG组、POAG组和对照组血清中VCP和α-fodrin的含量。分别对VCP和α-fodrin绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC），计算曲线下面积（area under curve，AUC），AUC为0.5~0.7提示诊断效能较低，AUC为>0.7~0.9提示有一定的诊断效能，AUC>0.9提示具有较高的诊断效能。根据ROC曲线图中的敏感度和1-特异度对应的坐标点，计算约登指数。选取最大约登指数对应的浓度作为判别的临界值，根据临界值将原始数据离散为二分类变量后，分别进行单因素和多因素Logistic回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　各组VCP和α-fodrin的含量　VCP和α-fodrin在POAG组、PACG组和对照组中的含量见表1，组间均数经Bartlett检验证实方差齐。POAG组、PACG组和对照组3组间两两相比，VCP、α-fodrin的含量差异均有统计学意义（均为P<0.05）。VCP、α-fodrin在POAG组均高于PACG组，两组又均高于对照组。



2.2　VCP和α-fodrin的诊断性ROC分析　VCP和α-fodrin两种指标的ROC见图1。VCP的AUC为0.754（95%CI为0.646~0.862，P<0.001），提示具有一定的诊断效能；α-fodrin的AUC为0.610（95%CI为0.486~0.733，P=0.091），提示无诊断价值。
2.3　POAG和PACG患者发病的多因素Logistic回归分析　根据图1中的敏感度和1-特异度对应的坐标点，计算约登指数（敏感度+特异度-1）对应最大值时各指标的临界值。根据临界值将原始数据（POAG组和PACG组）离散为二分类变量，分类标准：VCP<108.020 ng·L^-1时赋值为0，VCP≥108.020 ng·L^-1时赋值为1；α-fodrin<0.335 μg·L^-1时赋值为0；α-fodrin≥0.335 μg·L^-1时赋值为1。并将转化后的两个分类变量进行多因素Logistic回归分析，结果示，VCP是POAG患者发病的独立危险因素（OR=9.134，P<0.01），α-fodrin对POAG患者发病无影响 （OR=2.978，P=0.069）；VCP和α-fodrin对 PACG患者发病均无影响（OR=1.764、1.312，P=0.053、0.061）。



3　讨论
        青光眼是全球首要不可逆性致盲眼病，目前我国40岁以上人群中闭角型青光眼患者高达1010万，开角型青光眼患者达到1200万，且开角型青光眼患者数量有逐年上升的趋势^［9-10］。许多青光眼患者经过抗青光眼滤过手术、激光治疗、药物治疗后眼压降低到正常或低于正常眼压水平，但仍继续发生视野缺损、RGCs层厚度变薄和中心视力下降等视功能损害，提示除直接的压力损伤和局部缺血外，有其他因素参与青光眼RGCs的损伤过程^［11］。Bakalash等^［12］在摘除胸腺的大鼠上制作青光眼高眼压模型，发现摘除胸腺的大鼠RGCs的存活数量明显下降，进一步提示免疫因素在青光眼的发病中占有一定的地位。Hata等^［13］将其先前合成的VCP调节剂（KUS121）注入视网膜缺血性损伤的小鼠体内，发现KUS121可以抑制内层视网膜的变薄和RGCs的死亡，通过视网膜电图检查发现，KUS121对于视功能也有较好的维持作用。既往研究多为抗体检测，本研究拟寻找青光眼疾病潜在的自身抗原标记物。
        本研究通过ELISA法测量VCP在青光眼患者外周血中的含量，发现VCP在PACG和POAG患者中的含量均升高，且在POAG患者中升高较为明显。在同类型的研究中，Lee等^［14］采用了同样的检测方法对相应抗体进行检测，发现在POAG患者体内VCP抗体含量较正常眼压型青光眼和正常人显著升高，并认为通过ELISA法同时检测VCP和α-fodrin可用于早期青光眼的筛查。VCP亦被称为p97或CDC48，是与多种细胞活性相关的三磷酸腺苷酶超家族中的一员^［15］，VCP参与了许多细胞活动，包括转录和代谢调节^［16］、DNA损伤应答^［17］、染色质重塑^［18］、内质网相关蛋白的降解^［19］、泛素依赖的蛋白降解^［20］等。Egerton等^［21］发现，在酵母模型中，VCP的突变可导致内质网相关蛋白降解障碍，当内质网压力升高和体积扩大时，将会导致氧化应激依赖的凋亡细胞的死亡^［22］。Tezel等^［23］将培养的人及鼠RGCs与HSP27抗体共孵育后，HSP27抗体由受体介导的内吞入胞机制进入培养的RGCs中，导致肌动蛋白细胞骨架降解增加，最终导致细胞凋亡。因而推测，青光眼患者体内VCP突变导致患者体内产生了具有攻击自身相关组织（如RGCs）的抗体，并通过一系列途径使RGCs凋亡增加，从而使青光眼患者的病情进一步恶化。但VCP突变的原因仍需更进一步研究。
        我们通过同样的方法测量α-fodrin在不同类型的青光眼患者外周血中的含量，发现在PACG和POAG患者中α-fodrin含量均升高，且POAG患者较PACG患者仅轻度升高。fodrin是细胞膜骨架蛋白的成分之一，在大多数哺乳动物细胞中均有表达，由α亚单位（相对分子质量为240 000）和β亚单位（相对分子质量为235 000）组成。α亚单位可能与膜离子通道和泵有关，参与细胞内钙离子浓度调节和腺体的分泌，在凋亡过程中可裂解出相对分子量为120 000 和150 000的片段^［24］。此外，α-fodrin在细胞凋亡早期可被半胱氨酸蛋白酶家族（Caspase）裂解，并导致结构重新排列，而且相对分子质量为 120 000 的片段是Caspase-3裂解的靶点。凋亡细胞的死亡会进一步激活蛋白裂解级联反应^［25］。Caspase对于细胞凋亡起到了很大的作用，尤其是在慢性神经病变性疾病中，如亨廷顿舞蹈症、帕金森病和阿尔茨海默病^［26］。Grus等^［27］发现，德国和美国的青光眼患者体内相对分子质量为120 000的抗体滴度升高，经Western blot确定相对分子量为 120 000 的片段为α-fodrin。Tahzib等^［25］也在小鼠慢性高眼压模型的研究中发现Caspase-3活性增高，且α-fodrin的相对分子质量为120 000的片段被Caspase-3裂解的水平较对照组增加。而Caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的关键酶^［28］，Caspase-3可裂解细胞内许多关键蛋白，是凋亡的执行者^［29］。本研究发现，青光眼患者体内 α-fodrin水平升高，可能激活Caspase蛋白酶家族，使Caspase-3活性增高，导致Caspase的级联反应，引起了RGCs进行性凋亡，从而导致青光眼患者病情的进一步加重。
        ROC分析结果提示，VCP对于青光眼有一定的诊断效能；多因素Logistic回归分析提示，VCP是POAG患者发病的独立危险因素。因此，VCP可能是一种青光眼患者体内的特异性自身抗原，也提示其可能是青光眼诊断的潜在标记物。而α-fodrin对于青光眼无诊断价值，多因素Logistic回归分析提示，α-fodrin对POAG、PACG的发病均无影响。但Grus等^［27］研究结果显示，POAG患者外周血中α-fodrin的含量与正常人群有较大差异。导致这种差异的原因可能与不同研究的人种差异、样本大小不同有关，后续研究可通过同时测定抗原与抗体的试验设计，更全面地评估该指标在疾病的发生与发展中的作用。
        综上所述，本研究通过检测青光眼患者外周血中VCP和α-fodrin的含量，发现在POAG患者体内VCP和α-fodrin的含量均较PACG患者和正常人群升高，Logistic回归分析结果提示，VCP为POAG的独立危险因素，进一步证实了免疫因素在青光眼视神经损害机制中起一定作用，可为POAG的早期发现提供依据。