《眼科新进展》  2018年10期 935-939   出版日期：2018-10-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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血管内皮细胞生长因子抑制剂对视网膜血管内皮细胞自噬的促进作用


        视网膜新生血管是多种缺血性视网膜病变的共同病理特征，其继发的眼部病变，如玻璃体积血、增生性视网膜病变和新生血管性青光眼等，可导致眼部正常结构破坏，严重危害视功能，影响患者的生存质量。近年来抗血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）药物为此类疾病的治疗带来了巨大进展，然而仍然有高达30%的患者治疗后无明显效果^［1］，并且一些患者治疗后复发，出现眼部不良反应。因此，迫切需要探索视网膜新生血管的病理机制，并积极寻找新的防治策略。
        自噬是目前生命科学研究的热点，有研究证实，在视网膜疾病发展中，对处于氧化应激下的视网膜细胞而言，自噬是一把双刃剑，其水平变化可能具有神经保护作用或者通过启动细胞凋亡参与光感受器变性^［2-3］。我们的前期研究发现，抑制自噬联合抗VEGF在抑制视网膜新生血管中比单纯抗VEGF治疗效果更好，但具体机制有待探讨^［4］。基于此，本研究以小鼠视网膜血管内皮细胞（retinal vascular endothelial cells，RVECs）为对象，观察在缺氧条件下抗VEGF治疗对细胞自噬水平的影响，为明确自噬在治疗视网膜新生血管中的作用提供依据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验动物　正常健康6～8周龄C57小鼠，体质量20~25 g，由西安医学院实验动物中心提供。小鼠在12 h/12 h昼夜的光线环境下喂养，饲养温度为（25±1）℃，湿度为59%～61%。本研究实验动物的饲养和使用均遵照西安医学院和美国眼科及视觉研究学会（Association for Research in Vision and Ophthalmology，ARVO）关于眼科研究动物实验的相关规定。
1.1.2　主要试剂及仪器　小鼠视网膜微血管内皮细胞完全培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司）；3-MA（美国Selleck公司）；VEGF-A中和抗体（美国RD公司）；兔抗鼠LC3多克隆抗体、兔抗鼠Beclin-1多克隆抗体（美国CST公司）；兔抗鼠GAPDH多克隆抗体（杭州贤至生物有限公司）；Lip-ofectamine2000（美国Invitrogen公司），OPTI-MEM（美国 GIBCO 公司）；XhoI 和BamHI（日本TAKARA公司）；质粒PUC19-mus-LC3b（北京义翘神州生物技术有限公司）；PEGFP-N3载体（武汉巴菲尔生物技术服务有限公司）；IX51型倒置相差显微镜、BX53型荧光显微镜（日本Olympus公司）；HF-100型三气培养箱（上海力申科学仪器有限公司）；Multiskan MK3酶标仪（美国Thermo公司）；HT7700-SS型透射电子显微镜（日本HITACHI公司）。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养及鉴定　参照我们前期报道的研究方法对小鼠RVECs细胞进行原代培养和鉴定^［5］。处死C57BL/6J小鼠后分离视网膜组织，去除视网膜色素上皮细胞，剪除可见的主支大血管后剪碎、消化。终止消化后过滤细胞，收集洗脱液，离心弃上清，加入内皮细胞专用完全培养基。在培养皿底部标记RVECs的克隆，移除其他细胞，继续培养至细胞密度达80%时按1∶3的比例传代培养。采用CD34抗体进行内皮细胞鉴定。
1.2.2　细胞分组及处理　取生长状态良好的细胞，按每孔0.5×10⁶个细胞接种于6孔板。将细胞分为以下五组：正常对照组、缺氧对照组、3-MA组、anti-VEGF组和3-MA+anti-VEGF组。正常对照组细胞在常氧条件下培养；缺氧对照组细胞置于三气培养箱（体积分数为1%O₂、体积分数为5%CO₂、体积分数为94% N₂）中24 h；3-MA组细胞先用5 mmol·L^-1 3-MA预处理4 h，anti-VEGF组先用10 mg·L^-1 VEGF-A中和抗体预处理4 h，3-MA+anti-VEGF组联合使用3-MA及VEGF-A中和抗体预处理4 h，然后这3组细胞再置于三气培养箱中24 h。
1.2.3　Western blot法检测各组细胞中LC3和Beclin-1的蛋白表达　加入100~150 μL RIPA裂解液裂解细胞，提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。按每孔40 μg总蛋白加样，采用100 g·L^-1聚丙烯酰胺凝胶电泳在120 V条件下分离蛋白，之后在200 mA及90 min条件下将蛋白转移到PVDF膜上。采用含50 g·L^-1 脱脂奶粉的TBST封闭PVDF膜，室温摇床1 h。用封闭液稀释相应一抗LC3B、Beclin-1和GAPDH（均为1∶1000），浸泡PVDF膜于一抗孵育液中，4 ℃摇床过夜。TBST充分洗涤PVDF膜，用封闭液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶50 000），使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室温摇床孵育1 h。TBST充分洗涤PVDF膜，用ECL显色后利用BandScan成像系统拍照，并进行灰度信号分析，以GAPDH为内参照，计算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1蛋白相对表达量，每组重复测量3次，取其平均值。
1.2.4　GFP-LC3B质粒构建和转染　采用PCR从PUC19-mus-LC3b质粒扩增小鼠LC3B编码序列，引物序列如下：上游引物：GGACTCAGATCTCGAGATGCCGTCCGAGAAGACCTT，下游引物：TGGTGGCGATGGATCCCACAGCCATTGCTGTCCCGA。PCR产物经内切酶消化后，插入到pEGFP-N3载体的XhoI 和BamHI位点之间（称为pEGFP-LC3B）。根据操作说明，采用Lipofectamine 2000将1 μg pEGFP-LC3B 质粒转染RVECs以瞬时过表达LC3B，对照细胞为转染pEGFP-N3空载体的RVECs细胞。转染后20 h，RVECs按照1.2.2进行分组处理。在荧光显微镜下计数GFP阳性细胞和GFP阳性斑点细胞（明亮的绿色荧光斑点），在150个细胞里计算GFP阳性斑点细胞占GFP阳性细胞总数的百分比。实验重复3次，计算平均值。
1.2.5　透射电子显微镜下观察自噬体的形成　细胞刮轻轻刮下各组细胞，在4 ℃环境中用含有体积分数2.5%戊二醛的0.1 mol·L^-1磷酸盐缓冲剂（phosphate buffer saline，PBS）固定2~4 h；PBS漂洗3次，每次15 min；室温环境下在10 g·L^-1锇酸中固定2 h；PBS漂洗3次，每次15 min；采用连续梯度乙醇进行细胞脱水，将细胞先后包埋在丙酮-812包埋剂（1∶1混合）中和纯812包埋剂中各渗透24 h；置于聚合器中60 ℃聚合48 h；使用超薄切片机制备 60~80 nm超薄切片。对超薄切片进行铀铅双染色（20 g·L^-1醋酸铀饱和水溶液及枸橼酸铅中各染色15 min）；切片室温干燥过夜，透射电子显微镜下观察双层膜状结构的自噬体以及其他相关亚细胞结构。
1.3　统计学分析　采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，所有数据以均数±标准差表示。组间差异采取单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1的蛋白表达　Western blot检测结果显示，与正常对照组相比，缺氧对照组细胞的自噬被激活，细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ以及Beclin-1蛋白表达均明显增强，而3-MA组细胞中两种蛋白表达均稍弱于缺氧对照组。anti-VEGF组细胞中两种蛋白表达明显强于缺氧对照组、3-MA组及正常对照组，而3-MA+anti-VEGF组中的蛋白表达又明显弱于anti-VEGF组，强于3-MA组和正常对照组（图1、图2）。




2.2　GFP阳性斑点细胞百分比　荧光显微镜下可见各组细胞中均有绿色荧光斑点，与正常对照组相比，缺氧对照组GFP阳性斑点细胞比例明显升高，而3-MA组该比例稍低于缺氧对照组。anti-VEGF组细胞中该比例稍高于缺氧对照组、3-MA组，明显高于正常对照组，而3-MA+anti-VEGF组中的比例又稍低于anti-VEGF组，稍高于3-MA组，明显高于正常对照组（图3、图4）。
2.3　细胞中自噬体超微结构的观察　透射电子显微镜下可见5组细胞内均有自噬体形成，典型者呈双层膜样的液泡状结构，小体内可见胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等吞噬物。正常对照组细胞中仅见少量自噬体，缺氧对照组细胞中自噬体数量明显增多，3-MA组细胞中自噬体少于缺氧对照组，但仍多于正常对照组。anti-VEGF组自噬体比缺氧对照组中增多，3-MA+anti-VEGF组自噬体又比anti-VEGF组中减少（图5）。





3　讨论
        缺氧可以促进血管生成因子的释放，从而刺激内皮细胞增殖和分化，诱导血管生成^［6-7］。作为代谢最为活跃的人体组织，视网膜对缺氧及继发的氧化应激高度敏感。多种缺血性视网膜疾病，包括糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变和视网膜静脉阻塞都与缺氧密切相关^［8-10］。因此，本研究将缺氧作为刺激条件，观察抗VEGF与自噬的关系。首先我们发现，与正常对照组相比，缺氧对照组RVECs中的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1蛋白相对表达、GFP-LC3B的表达和自噬体均明显增加，3-MA组细胞中上述指标较缺氧对照组明显降低。与前期报道结果一致^［5］，本研究也证实，缺氧显著促进了RVECs自噬的激活。
        正常情况下，内源性血管抑制因子的影响占优势，无病理性增生血管出现。在病理状态下，如长期的缺氧、高血糖状态会导致血管生成因子表达的增多和（或）血管抑制因子降低，导致视网膜新生血管产生。众所周知，VEGF是促进新生血管形成的关键因子，它能够促进血管内皮细胞分裂与增殖，增加血管通透性，诱导血管生成^［11］；还可以上调血浆纤溶酶原激活物表达，引起血浆蛋白外渗，激活多元醇代谢途径，增加内皮细胞对葡萄糖的转运，诱发甘油二酯-蛋白激酶C机制，促进血管生长^［12-13］。研究证实，缺氧可以诱导VEGF的表达，其特异性抑制剂能显著抑制视网膜新生血管的生成^［14］，故临床上抗VEGF药物成为了治疗视网膜新生血管的有力武器。然而，该治疗策略并非能完全奏效，故视网膜新生血管形成的其他机制值得探究。我们的前期研究发现，缺氧条件下内皮细胞自噬激活可以促进血管生成^［5，15］，而抗VEGF抑制视网膜新生血管的作用被削弱可能与自噬激活有关。
        在生理以及病理的条件下，细胞均存在一定程度的自噬，处于正常范围内的自噬对细胞能够起到一定的保护与修复作用^［16-17］。自噬相关的特异性基因编码相应的蛋白，以协同的方式参与自噬体形成的各个阶段。其中，LC3以 LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ两种形式存在，当自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-Ⅰ）酶解掉一小段多肽，转变为自噬体膜型（即LC3-Ⅱ），利用Western Blot检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的大小可评估自噬水平的高低^［18］。哺乳动物中有三种LC3，包括LC3A、LC3B和LC3C，LC3B是目前最常用的自噬分子标记物。Beclin-1是其他自噬蛋白基因参与自噬形成过程的必需成分^［19］，也常被用作自噬标记物。电子显微镜是检测自噬体的直接方法，也是定性和定量检测自噬体的金标准^［18］。鉴于在电镜样品制备过程中可能造成结果误差，如不同切面自噬泡个数不同，则从该切面所得结果可能与整个细胞的自噬状况相距较大，本研究只对各组细胞电镜下的自噬体进行了观察，未对其进行定量分析。电镜耗时长不利于自噬监测，故采用GFP-LC3融合蛋白示踪自噬形成的技术应运而生。自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白从胞浆中转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。本研究采用以上三种方法观察细胞内的自噬情况，以弥补单一方法可能带来的误差。
        3-MA作用于早期的自噬诱导阶段，是广泛应用的一种自噬抑制剂。本研究发现，anti-VEGF组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1表达量、GFP阳性斑点细胞比例和自噬体数量均高于缺氧对照组，而联合使用3-MA后这些指标又降低，提示VEGF抑制剂可以激活自噬，这一结果与文献采用其他内皮细胞和VEGF抑制剂的报道相似^［20-22］，自噬可能是抗VEGF抑制视网膜新生血管的作用被削弱的机制之一。目前对于视网膜新生血管尚无安全且长期有效的治疗方法，我们的研究结果提示，自噬可以作为增强血管生成抑制剂疗效的新靶点。然而，体外实验结果不能完全代表体内视网膜新生血管的真实情况，且临床上使用的VEGF抑制剂与本研究使用的VEGF抗体是否具有同样的效应还不得而知。此外，小鼠与人的视网膜血管内皮细胞特征存在种属差异，本研究获得的结果也不能完全反映人视网膜实际的病理生理状态。因此，还需要采用眼科常用的VEGF抑制剂在人的视网膜血管内皮细胞和动物模型中进行研究，对VEGF抑制剂激活血管内皮细胞自噬的机制也需深入探讨。