《眼科新进展》  2018年9期 851-855   出版日期：2018-09-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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中国汉族人群SOX2基因与高度近视的关联研究


        目前近视的确切发病机制尚不清楚，研究表明，其发生和发展是多因素的，与环境因素、遗传因素和环境-遗传相互作用密切相关^［1-3］，尤其是遗传因素在高度近视的发生和发展中起着关键作用^［4］。近年来，高度近视的患病率逐年升高，预计到2050年，全球高度近视约9.38亿人（约占世界人口的9.80%），且黄种人患病率高于白种人^［5］。高度近视具有明显的家族聚集性及遗传倾向，是一种单基因遗传眼病，常见的遗传方式有常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传和X-连锁隐性遗传^［6-7］。SOX2是性别决定区Y-box转录因子基因家族的成员，在眼球的早期发育中起着关键作用，并且SOX2的突变可导致小眼球或无眼球等在内的多系统异常^［8］，提示该基因可能是屈光不正的一个候选基因^［9］，因此我们选取了可能与高度近视发生发展相关的SOX2基因，筛选出三个标签单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）进行测序分析，试图寻找与高度近视关联的位点，探究SOX2基因与高度近视的关联性。
1　资料与方法
1.1　一般资料　收集2016年1月至2017年1月川北医学院附属医院眼科门诊就诊的200例患者，其中高度近视者117例(211眼)为病例组，女66例，男51例，年龄18～34（28.17±5.38）岁；正视者83例（160眼）为对照组，女45例，男38例，年龄18～37（25.12±6.32）岁。两组间年龄和性别构成差异均无统计学意义（均为P>0.05）。
        纳入标准：（1）所有受试者均为中国汉族人，样本间无血缘关系；（2）高度近视者要求双眼等效球镜度数 ≥-6.00 D；（3）对照组双眼等效球镜为-0.50~0.50 D，裸眼视力为1.0；（4）近2 a视力稳定。排除标准：（1）角膜、晶状体等屈光介质混浊者；（2）与近视相关的全身遗传性疾病，如Marfan综合征、Stickler综合征、眼球-食管闭锁-生殖器异常综合征等；（3）幼年有长时间高热病史；（4）近2周有角膜接触镜配戴史；（5）有圆锥角膜者；（6）合并其他易导致高度近视的疾病。本研究严格遵循赫尔辛基宣言，并经过川北医学院伦理委员会批准，受试者均知情同意并签署知情同意书。
1.2　方法
1.2.1　眼部检查　询问近视的发病史并完成一套完整的眼部检查，如验光、裂隙灯检查、眼底镜检查等，同时测量所有受试者的眼球生物学相关参数，包括复方托吡卡胺滴眼液散瞳后采用综合验光仪测量双眼屈光度，法国光太AVISO眼科 A/B超测量眼球玻璃体腔长度，德国蔡司IOL Master测量角膜曲率半径（包括垂直角膜曲率半径和水平角膜曲率半径）、前房深度、晶状体厚度及眼轴长度，采用德国海德堡Spectralis OCT的增强深度成像模式（EDI模式）测量黄斑中心凹下脉络膜厚度（subfoveal choroidal thickness，SFCT），所有检查均由同一位经验丰富的专业验光师完成，每眼测量5次后取平均值。
1.2.2　DNA提取　在眼部检查完成后，抽取所有受试者前臂肘静脉血5 mL，EDTA抗凝，采用天根生化科技（北京）有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒（离心柱法），按其操作说明书提取外周血白细胞基因组DNA，并于-70 ℃下保存。
1.2.3　标签SNP的选取　在国际人类基因组单体型图计划（Haplotype Map Project，简称HapMap计划）公布的45个独立的中国汉族北京居民（CHB）的基因型数据（http：//www.hapmap.org）中选择标签SNP（数据来源于HapMap Data Rel 27 Phase Ⅱ+Ⅲ，Feb09，on NCBI B36 assembly，dbSNP b126数据库），并按照次等位基因频率>0.1，最小连锁不平衡相关程度（r²）值>0.8，选取了3个标签SNP，详细信息见表1。



1.2.4　引物设计　采用SNP直接测序法对三个标签SNP进行基因分型，PCR扩增过程中设计的引物序列见表2。10 g·L^-1琼脂糖凝胶电泳，150 V、100 mA，电泳20 min后观察。



1.3　统计学方法　采用SPSS 23.0统计学软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x?±s）表示，病例组和对照组受检眼眼球生物学相关参数测量结果的差异比较采用独立样本t检验；受检眼各项眼球生物学相关参数关系分析采用偏相关分析。使用Hardy-Weinberg平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）检验分析病例组和对照组中样本人群的代表性。在单个标签SNP位点中，采用χ²检验比较病例组和对照组之间基因型和等位基因频率的差异，并采用Bonferroni法进行多重检验修正。P＜0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　两组眼球生物学相关参数的比较　病例组和对照组的水平角膜曲率半径、垂直角膜曲率半径、前房深度、晶状体厚度、玻璃体腔长度、眼轴长度及SFCT值相比，差异均具有统计学意义（均为P＜0.01），见表3。



2.2　两组眼球生物学相关参数偏相关分析结果　受检眼屈光度与水平角膜曲率半径、垂直角膜曲率半径、SFCT均呈正相关（r=0.53、0.54、0.75，均为P＜0.01），即屈光度数值越小，也就是高度近视的度数越高，角膜曲率半径值越小，角膜屈光力越强，而SFCT越薄；屈光度与玻璃体腔长度、眼轴长度均呈负相关（r=-0.78、-0.87，均为P＜0.01），即屈光度数值越小，也就是高度近视的度数越高，眼轴越长，玻璃体腔越长；眼轴长度与玻璃体腔长度呈正相关（r=0.85，P＜0.01）；眼轴长度与水平角膜曲率半径、垂直角膜曲率半径和SFCT均呈负相关（r=-0.53、-0.52、-0.59，均为P＜0.01）。
2.3　三个标签SNP基因分型检测结果
2.3.1　三个标签SNP位点PCR反应产物　SOX2基因三个标签SNP位点PCR的反应产物见图1，可见PCR反应产物与引物设计吻合。
2.3.2　三个标签SNP位点基因型统计结果　对SOX2基因的三个标签SNP位点（rs11915160、rs4575941、rs4459940）进行基因型检测，经HWE检验，三个标签SNP位点的基因型结果在病例组和对照组中都符合HWE（均为P>0.05），提示本研究人群具有一定的代表性，三个位点的基因分型结果具有可靠性。三个标签SNP位点基因型统计结果（表4）显示，rs4575941位点的基因型频率在病例组和对照组之间差异有统计学意义（P=0.04），而rs11915160、rs4459940位点的基因型频率在病例组和对照组之间差异均无统计学意义（P=0.85、0.76）。




2.3.3　三个标签SNP位点等位基因频率统计结果　三个标签SNP位点等位基因频率统计结果（表5）显示，rs11915160、rs4459940位点的等位基因频率在病例组和对照组之间差异均无统计学意（P=0.74、1.00），rs4575941位点的等位基因频率在病例组和对照组之间的差异有显著统计学意义（P=0.03），但经Bonferroni法矫正后的P值为0.09，矫正后差异无统计学意义。rs4575941在病例组中的等位基因G频率明显高于对照组，OR值为1.58。



3　讨论
        SNP是人类DNA遗传变异中最常见的变异类型，也是绘制复杂遗传性状的有效资源^［10-11］，具有位点丰富、分布广、易于快速筛查与基因分型等优点，已成为当今基因组研究的主要遗传标记方法^［12］。通过确定基因中的遗传多态性在病例组和对照组中的基因型，来对比病例组与对照组之间基因型频率和等位基因频率的差异，此即病例-对照关联研究。运用病例-对照关联研究可推断基因多态性与多种疾病的遗传易感性^［13］，帮助人类成功鉴定出许多疾病的易感基因^［14-15］。某些遗传位点可能在特定种族人群中的表达不同，或在不同种族中等位基因频率的差异很大，从而造成某些疾病在不同种族人群中的差异性，如黄种人高度近视患病率明显大于白种人^［5］。SOX2基因参与眼球发育过程，提示SOX2基因可能与屈光不正有关联，但是目前中国汉族人群中SOX2基因是否与高度近视具有关联性暂无相关报道，所以本研究选择中国汉族人群作为研究对象，探讨SOX2基因是否可作为中国汉族人群高度近视的候选基因。本研究中，病例组和对照组人群中的三个标签SNP位点的基因型都符合HWE（均为P>0.05），表明本研究选取的研究对象具有一定的代表性，三个位点的基因分型结果具有可靠性。
        基于人群的研究发现，眼球角膜曲率、前房深度、晶状体厚度和眼轴长度之间的相互协调确定了眼球的屈光状态，其中眼轴长度对屈光状态的改变起着主要作用，且眼球的这些参数具有一定的遗传性和家族聚集性^［16-17］。本研究结果也表明，眼轴长度与屈光度的相关性最为突出（r=-0.87，P＜0.01），且高度近视眼的眼轴长度明显大于正视眼（P＜0.01），表明本研究对象中的高度近视主要为轴性近视。有研究报道指出，在高度轴性近视眼中，眼轴的延长主要表现为玻璃体腔的延长^［18-19］，而且随着眼轴的延长，眼球后极部巩膜发生重塑^［20］。眼轴过长产生的机械性应力使后极部脉络膜明显变薄^［21-22］，从而出现眼底视网膜的退行性改变。本研究结果发现，高度近视患者的水平角膜曲率半径、垂直角膜曲率半径均比正视眼小，前房深度比正视眼深，晶状体厚度小于正视眼；偏相关分析结果发现，屈光度数与水平角膜曲率半径、垂直角膜曲率半径均呈正相关（r=0.53、0.54，均为P＜0.01），而与玻璃体腔长度、眼轴长度均呈负相关（r=-0.78、-0.87，均为P＜0.01）；眼轴长度与玻璃体腔长度呈正相关（r=0.85，P＜0.01），与水平角膜曲率半径、垂直角膜曲率半径均呈负相关（r=-0.53、-0.52，均为P＜0.01），表明屈光度数值越小，也就是近视的度数越高，水平角膜曲率半径和垂直角膜曲率半径越小，眼轴越长和玻璃体腔长度越长，此结果与既往雷佳红等^［23］、王英等^［24］研究结果一致。屈光度数与SFCT呈正相关（r=0.75，P＜0.01），眼轴长度与SFCT呈负相关（r=-0.59，P＜0.01），即屈光度数值越小，也就是近视的度数越高，SFCT越薄，此结果与Nishida等^［25］、Flores-Moreno等^［26］研究结果一致。
        SOX2基因又称为SRY-box2，高度保守，仅有一个外显子，属于SOX转录因子家族，其广泛分布于动物界，涉及功能众多^［8］。SOX2是胚胎发育的重要调节因子，在早期发育和器官的发生中起着关键的作用，是必不可少的发育调节因子，具有决定性别、维持垂体-下丘脑、参与视觉系统发育和中枢神经系统发生等的功能^［27-29］。在眼球的发育过程中，越来越多的证据表明SOX2协同PAX6参与诱导晶状体的发育和眼球形态的形成^［30-32］，并且SOX2参与调节视网膜祖细胞的分化^［29］，由此可见，SOX2基因在眼球发育过程中有重要作用。有研究发现，SOX2基因缺陷可导致小眼球、无眼畸形^［33-34］，甚至出现全身性异常，如眼球-食管闭锁-生殖器异常综合征，可表现为眼、脑、垂体、泌尿生殖、胃和食管等的异常^［35-36］，在一定程度上说明了SOX2基因缺陷导致疾病的临床表现具有复杂性和多样性。本研究针对SOX2基因在HapMap数据库中选取了三个标签SNP进行基因分型，结果发现，rs4575941位点的基因型频率和等位基因频率在病例组和对照组之间差异具有显著的统计学意义（P=0.04、0.03），然而经Bonferroni法矫正，矫正后等位基因频率差异无统计学意义（Pc=0.09）。但我们观察到rs4575941位点的等位基因G在病例组中的频率明显高于对照组，OR值为1.58，说明等位基因G可能是高度近视的一个危险基因，提示SOX2基因的rs4575941位点可能与高度近视相关。
        有研究指出，Bonferroni矫正法应用于 SNP检测的多重比较时相对比较保守，可能会漏失某些阳性的发现，存在校正过度的可能，即增加了假阴性的几率^［37］。考虑到SOX2基因在眼球发育过程中的重要作用以及Bonferroni矫正可能存在的假阴性结果，我们认为，中国汉族人群SOX2基因遗传区域中的rs4575941位点与高度近视间的关联存在可疑性，需要进一步研究汉族人群SOX2基因与高度近视的关联。Simpson等^［9］在大量研究队列中调查了英国普通近视与PAX6和SOX2的关系，从数据库中筛选出SOX2基因的三个位点rs12497248、rs11915160和rs4459940，结果发现，PAX6和SOX2基因与普通近视没有显著关联，认为在寻找屈光不正的遗传基因时，PAX6和SOX2基因都不应该被列为优先考虑者。Simpson等^［9］研究的对象是英国的普通近视患者，且未研究SOX2基因的rs4575941位点，目前已有研究发现中国汉族人群PAX6基因与高度近视之间存在显著的关联性^［38-39］。考虑到在不同研究人群中高度近视的候选基因与近视的关联性可能有所不同，而且高度近视的病因复杂，涉及多种遗传和环境因素，所以下一步我们将扩大样本量，选取SOX2基因上更多的基因位点，选择合适的多重检验方法，并结合其他手段进行大数据分析，希望更好地了解中国汉族人群中SOX2基因与高度近视之间的关联性，试图找出与高度近视相关的候选基因，从而为寻找近视的发病机制奠定基础。