《眼科新进展》  2018年9期 810-814   出版日期：2018-09-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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蒙脱石滴眼液对小鼠泪膜功能和角膜上皮厚度的影响


        蒙脱石干燥剂是常见的食品干燥剂，作为自然生成的矿物，蒙脱石因其强大的吸附能力、良好的流变特性、化学惰性而成为多种食品干燥剂的主要成分^［1］。因为害怕浪费，很多人在食物吃完以后把干燥剂留住希望用作其他用途，一些人还把它存储在罐子中，这些都造成了潜在的隐患，尤其对于儿童而言，出于好奇，常使得干燥剂误入眼内，因蒙脱石干燥剂的特性常会导致眼表微环境的破坏，引起眼表损害。临床上干燥剂误入眼内的病例屡见不鲜。本研究旨在探索食物干燥剂蒙脱石对小鼠泪膜功能和角膜上皮厚度的影响，以期为食品干燥剂蒙脱石不慎入眼的临床情况的治疗提供一定的理论基础。
1　材料与方法
1.1　实验动物　24只6~8周龄BABL/c雄性小鼠（体质量18~22 g，南昌大学医学院实验动物中心提供），均为无特定病原体级（SPF级），实验前先进行眼科检查，在裂隙灯显微镜下观察有无角膜异常，整个实验过程均在标准环境下饲养^［2］。所有小鼠都给予相同的水量和食物。此研究全部的实验方法都遵照《赫尔辛基宣言》，研究符合动物伦理委员会的规定^［3］，对实验动物充分尊重，尽量减少实验动物的痛苦。
1.2　滴眼液的制备　食品干燥剂蒙脱石用无菌PBS稀释为15 g·L^-1，随后进行超声涡旋。分别在蒙脱石滴眼液和PBS滴眼液中添加苯扎溴铵0.005 g保存，其质量分数控制在0.005％以下，4 ℃冰箱保存备用。
1.3　分组及处理　将24只小鼠随机分成A、B两组，每组12只，A组用15 g·L^-1食物干燥剂蒙脱石滴眼液滴眼，B组用PBS滴眼，每天3次，分别于滴眼后1 d、4 d、7 d行泪液分泌试验（Schirmer Ⅰ test，S Ⅰ T）、泪膜破裂时间（break up time，BUT）检测，进行角膜荧光素（fluorescein，FL）染色来观察角膜上皮厚度的改变情况。在滴眼后7 d进行光学相干断层扫描血管造影（optical coherence tomography angiograph，OCTA）检查，评估角膜上皮厚度的改变。
1.4　方法
1.4.1　S Ⅰ T方法　酚红棉线的一头放于小鼠右眼外眦中外1/3位置，持续60 s。测量酚红棉线浸润变红部分的长短，计算泪液分泌量。泪液分泌检测要严格控制变量，即同一人在同一时刻、场所，同样的照明、湿度及温度下进行所有检测。
1.4.2　BUT检测　参考相关文献^［4］，将 1 μL的10 g·L^-1 荧光素钠用移液枪滴入小鼠眼表，并辅助其眨眼，使荧光素钠很好地附着在眼表，随后在裂隙灯显微镜下记录小鼠的BUT。注意移液枪的枪头不要触及小鼠眼表，以免造成不必要的损伤而影响实验结果。
1.4.3　角膜FL染色　给实验小鼠滴1滴10 g·L^-1荧光素钠滴眼液，辅助其眨眼，评分系统参考文献^［5］标准，计分标准如下，0分：无任何染色；1分：轻微散在点状着染，＜30个点；2分：点状着色>30点，但未发生融合；3分：浸润弥漫性着色，没有斑块；4分：有荧光素斑块。
1.4.4　OCTA检查　应用AngioVue OCTA系统（Optovue，Inc.，Fremont，CA），选择视网膜成像（AngioRetina模式），采用分频辐去相关血管造影算法（split-spectrum amplitude-decorrelation angiography，SSADA），由于系统的默认焦点是视网膜，关闭自动对焦功能，套上眼前节探头，手动调整焦距进行成像。确定扫描中心，关闭自动聚焦功能，设置5 μm的轴向分辨率，15 μm的横向分辨率，应用波长840 nm、宽度22 μm的光源获取3D扫描图像^［6］。利用系统软件，按以下分区标准将角膜划分为17个区域：确定扫描中心为圆心，2 mm、5 mm、6 mm为直径作为圆形扫描区域，分别作为角膜中央、内环和外环；同时，按上侧（superior，S）、鼻上侧（superior nasal side，SN）、鼻侧（nasal side，N）、鼻下侧（inferior nasal side，IN）、下侧（inferior，I）、颞下侧（inferior temporal side，IT）、颞侧（temporal side，T）、颞上侧（superior temporal side，ST）对内环和外环均分为17个区域角膜上皮厚度进行测量。
1.4.5　测量和分析　对A组和B组所有小鼠进行测量，并分析其角膜中心直径2 mm区域和内环、外环共17个分区的角膜上皮各区域的局部厚度和变化量，获得各区域角膜上皮厚度。
1.5　统计学方法　统计学分析使用SPSS 17.0软件进行，采用x?±s表示计量资料，不同组不同时间的对照采取重复测量数据的方差分析，同一时间的角膜上皮厚度对比采取t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　泪膜功能评估结果对比
2.1.1　S Ⅰ T　A组与B组滴眼前和滴眼后1 d、4 d和7 d S Ⅰ T比较，结果显示：不同时间点间的S Ⅰ T有差别（F=10.864，P=0.006）；A组与B组S Ⅰ T有差别（F=19.731，P=0.009），A组较B组S Ⅰ T低，泪液分泌破坏显著；A组与B组的S Ⅰ T变化趋势也有明显差别（F=11.152，P=0.005）。滴眼后4 d和7 d，两组S Ⅰ T比较，差异均有统计学意义（t=3.847、5.695，P=0.026、0.009）。见表1。



2.1.2　BUT检测　A组与B组滴眼前和滴眼后 1 d、4 d和7 d BUT比较，结果显示：不同时间点间的BUT有差别（F=9.342，P=0.007）；A组与B组BUT有差别（F=22.432，P=0.001），A组BUT较B组低，泪膜破坏明显；A组与B组的BUT变化趋势也有明显差别（F=8.451，P=0.006）。滴眼后4 d和7 d，两组BUT比较，差异均有统计学意义（t=5.753、5.695，P=0.024、0.009）。见表2。
2.1.3　角膜FL染色评分　A组与B组滴眼前和滴眼后1 d、4 d和7 d角膜FL染色评分比较，结果显示：不同时间点间的FL染色评分有差别（F=8.532，P=0.012）；A组与B组FL染色评分有差别（F=14.753，P=0.003），A组较B组角膜上皮破坏明显；A组与B组的FL染色评分变化趋势也有明显差别（F=8.251，P=0.004）。滴眼后4 d和7 d，两组FL染色评分比较，差异均有统计学意义（t=7.536、9.864，P=0.031、0.012）；见表3。正常小鼠角膜上皮完整，A组小鼠干预7 d后FL染色区域明显增加（图1A、B、C、D），B组小鼠干预7 d后角膜染色无明显变化（图1E、F、G、H）。





2.2　蒙脱石混悬液对小鼠角膜上皮厚度的影响　A组与B组在干预7 d后，分别测量角膜各区域角膜上皮厚度，结果发现：滴眼7 d后，与B组相比，A组各区域角膜上皮厚度均明显变厚，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。见表4。



3　讨论
        蒙脱石为膨润土矿的主要成分，因为本身有特殊的层状结构，因此吸附能力较强，又因其自身的惰性，在工业上成为食品干燥剂的首选材料之一^［7］。目前主要由氧化钙构成的生石灰干燥剂具有良好的干燥吸水效果，但有一定毒性。蒙脱石不仅吸附速度快，吸附能力高，而且没有气味，不污染环境，还拥有静态减湿和去除异味等功能，最重要的是毒性较轻微，故相较氧化钙，蒙脱石更适合作为食品干燥剂。蒙脱石滴眼液呈弱碱性（pH 7.4），因为自身特殊的结构而有极强的吸水能力，与水混合会迅速吸水凝固变硬，因此与眼部接触后会持续吸收眼表水分，迅速破坏眼表湿润的微环境^［6，8］，这可能是其损伤眼表的主要机制。随着社会发展，食品保存技术不断提高，食品干燥剂在我们生活中出现的频率越来越高，使得其与人体接触的机会大大提高，尤其对于儿童而言。而时刻与外界环境接触的眼表，尤其容易与之接触。
        目前关于蒙脱石对眼表损伤的研究尚少。已有临床研究发现，接触膨润土矿可使眼表发生炎症反应，并通过动物实验证明了膨润土矿对眼表的损害作用^［9］，但未深入评估其对眼表功能的影响，也未发现其中主要是何种成分造成眼表损伤。本研究较深入地评估了膨润土矿成分蒙脱石对眼表功能的影响。研究使用小鼠为研究对象是因为其眼表和人相似，角膜上皮细胞均由外胚层发育而来，将角膜分层，使之处于非角化状态^［10］。本研究表明，蒙脱石对眼表的主要损害是破坏泪膜稳定性引发干眼症状。
        泪膜的主要功能是维持眼表水分稳定^［10］，对获取清晰视力起到了不可或缺的作用，当眼表水分丢失时，泪膜的功能受损，导致眼部出现的各种不适症状称为干眼综合征^［11］，表现为眼部难受，感觉有异物，且有视物疲劳和视物模糊等症候^［12-13］。眼表的腺体分泌受中枢神经系统调控，当泪膜损伤，眼表的光滑度变差，中枢神经系统的调控作用也会随之下降^［14］，进而导致更严重的损伤。因此，保护泪膜的稳定性显得尤为重要，吸烟、维生素缺乏和性激素失调等都可以导致干眼^［15-18］。为了探索食品干燥剂蒙脱石对眼表的影响，本研究采用蒙脱石混悬液滴眼，结果表明滴眼后1 d、4 d、7 d，与B组相比，A组泪液分泌破坏明显，BUT大大缩短，角膜FL着染显著增加，说明蒙脱石接触眼表后，使泪液分泌功能受到破坏，泪膜稳定性降低，同时破坏眼表上皮细胞。处理7 d后，相比于B组，A组各个区域角膜上皮厚度均明显变厚，进一步表明蒙脱石对角膜上皮细胞的损害。因此，结合蒙脱石特性，提示其损伤眼表可能通过破坏泪膜，进而引发眼表微环境改变引起干眼症状而实现的。
        综上所述，食品干燥剂蒙脱石与眼表接触将破坏小鼠泪液分泌功能和泪膜稳定性，并损伤角膜上皮细胞。由此推想，接触食品干燥剂蒙脱石后，与小鼠眼表情况相似的人类眼表应当也会发生类似的改变，这对临床这类眼病的治疗提供了一定的参考。但蒙脱石损伤眼表的更深层面的机制仍不清楚，有待进一步探索以利于更好治疗方案的制定。