《眼科新进展》  2018年6期 587-591   出版日期：2018-06-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
NLRP3炎症小体在糖尿病视网膜病变中的作用


    糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是由于糖尿病患者血糖控制欠佳引起的严重微血管并发症之一。DR已成为全世界具有工作能力人群视力损害的重要原因之一［1］。在2050年，美国40岁以上DR患者数量将较2005年激增3倍［2］。故迫切需要对DR的发病机制进行研究，寻找“治本”的治疗方式，以从源头上减少DR的发生。目前大量研究表明多种发病机制可能参与到DR的发病中，如氧化应激、晚期糖基化终未产物的异常生成和堆积、蛋白激酶C系统活化及炎症反应等［3-6］。其中慢性低度炎症反应在DR的进展中起核心作用［6］。固有免疫反应在驱动机体慢性炎症及糖尿病相关并发症中起重要作用，而炎症小体家族是机体固有免疫反应组成部分，故炎症小体家族可能在DR的发生发展中起促进作用。
    NOD样受体（NLRs）与Toll样受体共同属于模式识别受体（pattern-recognition receptors，PRRs）。NLRs在固有免疫反应识别病原体相关分子模式和损伤相关分子模式中发挥关键作用。根据N-末端结构域的不同，NLRs被分为4种类型：NLRA、NLRB、NLRC和NLRP。目前研究较多是核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat receptor containing a pyrin domain 3，NLRP3）炎症小体。NLRP3炎症小体由NLRP3、细胞凋亡相关的斑点样蛋白质（apoptosis-associatedspeck-like protein，ASC） 和 caspase-1组成。关于NLRP3炎症小体的激活有以下3种形式：P2X7-ATP介导的离子通道、溶酶体破裂以及活性氧（reactive oxygen species，ROS）释放。在受到上述激活形式影响后，NLRP3与ASC结合，活化前体caspase-1，这样NLRP3炎症小体被激活，进一步刺激IL-1β、IL-18活化及释放，导致炎症反应，影响细胞器的功能及细胞膜的通透性，最终导致细胞凋亡。
    大量研究证明，NLRP3炎症小体在动脉粥样硬化、多发性硬化、2 型糖尿病、年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）等多种疾病的发病过程中发挥重要作用［7-8］。本文就NLRP3炎症小体在DR发病中的作用进行综述。
1　NLRP3炎症小体在DR中的作用
    血-视网膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）由内屏障及外屏障组成。内屏障是由视网膜毛细血管内皮细胞及其间的紧密连接构成，外屏障则是由视网膜色素上皮细胞及其间的紧密连接构成。BRB作为一种生理屏障，严格调控各种物质进出视网膜。病理状态下BRB首先受到破坏。糖尿病大鼠早期即出现BRB破坏，表现为视网膜结构层次不清，内核层及外核层排列紊乱，同时检测到视网膜上高表达的NLRP3、caspase-1、IL-1β和 IL-18，并且应用shRNA沉默NLRP3表达后，视网膜血管通透性下降，caspase-1、IL-1β、IL-18、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor,TNF-α）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的表达均下降［9-10］。Shi等［11］发现人视网膜色素上皮细胞在高糖环境培养后，ROS表达水平增加，NLRP3炎症小体激活后抑制细胞自噬，促进IL-1β分泌，加重高糖给视网膜细胞带来的损害。在高糖培养的人视网膜微血管内皮细胞中，NLRP3炎症小体相关成分及细胞凋亡较正常组明显增高，将NLRP3基因沉默后，细胞对高糖的耐受力增强，细胞凋亡率明显下降［10］。说明NLRP3炎症小体通过影响BRB结构及功能参与早期高血糖对视网膜的损害。
    慢性低度炎症导致视网膜血管闭塞及新生血管形成，使DR进入进展期，即增殖型糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy，PDR）［12］。视网膜新生血管会造成玻璃体积血、新生血管性青光眼等并发症。Loukovaara等［13］对DR患者的玻璃体进行检测，发现PDR患者玻璃体中的caspase-1、IL-18、VEGF的表达水平显著高于非增殖型糖尿病视网膜病变（non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR）患者，在PDR合并牵拉性视网膜脱离以及伴有活跃的视网膜新生血管的玻璃体中，NLRP3表达更显著。并且在PDR患者视网膜纤维血管膜中检测到高表达的NLRP3、caspase-1及IL-1β［14］。已有研究通过建立进展期DR动物模型，发现NLRP3炎症小体参与病理性视网膜新生血管的形成［15］。说明NLRP3炎症小体与DR病变严重程度密切相关。
    综上所述，NLRP3炎症小体激活后，通过破坏BRB的结构与功能及促进视网膜新生血管形成来参与DR的发生发展。
2　NLRP3炎症小体在DR中的机制
2.1　ROS-硫氧还原蛋白结合蛋白-NLRP3炎症小体通路　DR早期病变以毛细血管基底膜增厚、周细胞丢失及BRB破坏为特征。在长期高糖及糖尿病状态下，周细胞凋亡是最早出现的病理改变，其导致视网膜异常毛细血管形成及血管渗漏［16］。目前，关于在高糖状态下，视网膜周细胞凋亡的具体机制仍不明确。硫氧还原蛋白结合蛋白（thioredoxin-interacting protein,TXNIP)是一种能够促进氧化应激及细胞凋亡的蛋白，在细胞核、细胞质及线粒体均有表达。它能够与硫氧还原蛋白（thioredoxin，TRX）结合，抑制TRX清除ROS的能力。TXNIP受高糖影响，在视网膜周细胞内过度表达，引起细胞氧化应激、线粒体功能紊乱、DNA损伤及细胞凋亡，应用TXNIP抑制剂或者敲除TXNIP基因，能够抑制TXNIP异常增多引起的上述损伤［17］。在糖尿病大鼠视网膜病变早期，通过抑制TXNIP的表达可以减轻视网膜胶质增生及神经细胞的损伤［18］。另有研究表明，TXNIP使TRX与ROS解离，促进NLRP3炎症小体的激活、IL-1β的表达及细胞凋亡，在敲除TXNIP基因后，能够抑制NLRP3炎症小体激活，减少细胞凋亡［19］。Zhou等［20］发现在高血糖状态下，ROS表达增加，TXNIP与NLRP3相互作用，激活caspase-1及NLRP3炎症小体，进而使IL-1β活化。上述研究表明，TXNIP可能通过调控NLRP3炎症小体的表达而在DR中发挥作用。Chen等［10］将人视网膜血管内皮细胞置于高糖环境下培养，发现细胞内TXNIP、ROS表达水平增高，NLRP3炎症小体被大量激活，并伴随细胞凋亡及视网膜血管通透性增加等改变，在利用ROS的抑制剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）、shRNA沉默TXNIP的表达后阻止NLRP3炎症小体组装，抑制IL-1β、IL-18的活化和细胞凋亡。根据上述研究结果，ROS-TXNIP-NLRP3炎症小体通路与DR的发病机制密切相关。
2.2　核因子-κB-NLRP3炎症小体通路　核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）是一种重要的调控炎症反应的转录因子。氧化应激能激活NF-κB并使其视网膜上过度表达，导致IL-1及TNF-α的表达增加。众所周知，周细胞丢失是DR的标志［16］。在高糖环境下，活化的NF-κB上调细胞凋亡基因，如caspase-3的表达，促进视网膜周细胞凋亡［21］。在糖尿病大鼠视网膜上也可检测到活化的NF-κB，在加入抗氧化剂后，NF-κB的表达下调［22］。另外，在高糖环境下，视网膜血管内皮细胞内NF-κB活化并促进炎性细胞因子及凋亡因子表达增高［23］。由此可知，NF-κB参与了DR的发展。NF-κB是激活NLRP3炎症小体的重要因素［10］。氧化应激激活NF-κB，使NF-κB的亚单位p65进入细胞核，导致NLRP3及下游炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）表达增加［24］。在糖尿病肾病小鼠模型中，NF-κB、NLRP3炎症小体相关成分在肾脏中高表达，应用NF-κB抑制剂后，NLRP3炎症小体表达降低，说明NF-κB-NLRP3炎症小体通路在糖尿病微血管并发症中发挥着重要作用［25-26］。Chi等［27］ 发现，在急性青光眼小鼠视网膜上，NLRP3炎症小体的激活依赖于NF-κB的作用。Liu等［28］发现，予以AMD大鼠玻璃体内注射NF-κB抑制剂后，NLRP3炎症小体激活被抑制，IL-1β、IL-18的表达下调。以上研究说明NF-κB-NLRP3炎症小体通路在视网膜疾病中发挥重要作用。在DR大鼠视网膜上，NF-κB、NLRP3炎症小体相关成分表达增加［9］。但NF-κB在DR中如何参与NLRP3炎症小体的激活，促进DR发展还需进一步研究证实。
2.3　转录因子E2相关因子2-NLRP3炎症小体通路　氧化应激是DR发病机制中研究较多的一类。转录因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）是一种抑制氧化应激及炎症反应的转录因子。Nrf2通过与抗氧化反应元件结合调控抗氧化及解毒酶类的表达，从而抑制炎症反应，如人醌氧化还原酶1［NAD（P）H quinine dehydrogenase 1，NQO-1］、血红素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、谷胱甘肽s-转移酶（glutathione S-transferase，GST）等。说明Nrf2在机体氧化应激过程中起保护作用［29］。抑制Nrf2的作用后将加重氧化应激对视网膜的损害［30］。Xu等［31］证实，在高糖状态下，Nrf2在糖尿病大鼠视网膜上被激活后，能够减轻氧化应激对视网膜 Müller细胞的损伤，敲除Nrf2基因后，大鼠视网膜谷胱甘肽生成减少，TNF-α表达增加，BRB破坏。另有研究表明，Nrf2对高糖培养的视网膜神经节细胞具有保护作用［32］。上述研究表明，Nrf2在DR中起保护作用。Nrf2激活后，引起NQO1大量表达，NQO1清除NLRP3炎症小体的激活剂ROS，下调NLRP3炎症小体的表达及阻止caspase-1、IL-1β的活化［33］。说明Nrf2可以通过减少ROS的表达来调控NLRP3炎症小体的活化。Liu等［34］ 发现在予以糖尿病大鼠非诺贝特治疗后，大鼠视网膜上Nrf2及NQO-1、HO-1表达水平增加，ROS生成减少，并阻断了NLRP3炎症小体激活。因此，可以得知Nrf2可通过抑制NLRP3炎症小体的激活而对DR起保护作用。
2.4　缝隙连接蛋白43半通道-ATP- NLRP3炎症小体通路　细胞之间的联系主要依靠细胞之间的缝隙连接。缝隙连接由2个连接小体或者半通道组成，连接小体及半通道由6个连接蛋白组成。缝隙连接允许相邻细胞进行小分子、离子和代谢物的交换。目前关于缝隙连接蛋白研究较多的是缝隙连接蛋白43（connexin 43，Cx43）。Cx43广泛存在于视网膜的各种细胞之间，如星形胶质细胞、小胶质细胞、视网膜色素上皮细胞及内皮细胞等。在AMD动物模型上，Cx43的表达与视网膜脉络膜炎症反应增强有关［35］。在应用Cx43半通道抑制剂多肽5后，视网膜脉络膜炎症减轻，阻止视网膜脉络膜变薄及视功能丢失，提示Cx43半通道能够成为缓解视网膜炎症状态的研究靶点［36］。在视网膜缺血动物模型上，多肽5能够减轻视网膜血管渗漏、炎症及视网膜胶质细胞丢失［37］。ATP通过半通道释放到细胞外后，激活细胞表面嘌呤受体P2X4、P2X7、P2Y12而发挥激活炎症小体的作用［38］。已有研究表明，应用多肽5后，Cx43半通道关闭，ATP释放减少，NLRP3、ASC、caspase-1表达下降［39］。说明在病理情况下，Cx43半通道能够介导ATP大量释放，刺激炎症小体活化。为了更加透彻理解Cx43半通道在DR中的作用，在一项研究中，将视网膜色素上皮细胞置于高浓度葡萄糖与多肽5共同培养，发现Cx43半通道关闭，ATP释放减少，NLRP3炎症小体激活被抑制［36］。说明抑制Cx43半通道-ATP- NLRP3炎症小体通路可以缓解高糖给视网膜带来的损害。
2.5　NIMA相关蛋白激酶7-NLRP3炎症小体通路　NIMA相关蛋白激酶7（never in mitosis gene A related kinase7，NEK7）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，具有调控细胞周期、促进细胞有丝分裂的功能。在正常生理状态下，NEK7活性较低，这对于机体稳态至关重要。过度表达NEK7会造成多核细胞异常增殖及细胞凋亡，二者与炎症过程密切相关［40］。已有研究证明NEK7是调控NLRP3炎症小体活化的因素之一［41］。NEK7作为一种NLRP3结合蛋白，能够通过调控下游钾离子外流而抑制NLRP3炎症小体的组装与激活［42］。Mcc950是NLRP3炎症小体特异性抑制剂。Zhang等［14］报道，高糖环境下的视网膜内皮细胞内NEK7与NLRP3之间的作用显著增强，予以Mcc950培养后，NEK7与NLRP3之间的相互作用减弱，NLRP3炎症小体被抑制，IL-1β分泌减少，视网膜炎症反应减轻。基于上述研究，说明NEK7通过NLRP3炎症小体通路促进DR的发生发展。
3　NLRP3炎症小体成为DR治疗新靶点可能性分析
    DR的治疗主要包括严密控制血糖、血压、血脂以及眼局部治疗，如视网膜激光及玻璃体切割术。然而应用于眼局部的药物屈指可数，故对眼局部药物的开发显得尤为重要。自从炎症反应被认为是DR重要发病机制之一以来，抗炎药物治疗DR已成为新选择，如皮质类固醇、VEGF抑制剂等。目前已发现多种药物能够抑制NLRP3炎症小体活化，如二甲双胍、槲皮黄酮和别嘌醇等，上述药物已应用于2型糖尿病、糖尿病肾病的治疗［43-44］。在DR中，Resolvin D1、非诺贝特、米诺环素、Mcc950等通过作用于不同的通路来抑制NLRP3炎症小体的激活，缓解高血糖给视网膜带来的损害［9-10，14，34］。故以NLRP3炎症小体作为治疗DR的新靶点，有重要的研究价值及广阔的应用前景。目前上述药物仅应用于细胞或者动物，仍需大量研究为临床应用提供可靠证据，为DR的诊治提供新选择。
4　小结
    NLRP3炎症小体是一种重要的蛋白复合物，作用机制复杂。过去对NLRP3炎症小体在多种炎症与免疫性疾病中的作用有了进一步的研究与认识。目前关于NLRP3炎症小体在DR发病中作用的研究方兴未艾，进一步研究其在DR发病中的分子机制以及相应的干预措施对于DR 的防治具有重要的理论意义和应用价值。