《眼科新进展》  2018年6期 501-505   出版日期：2018-06-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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急性视网膜缺血再灌注损伤后大鼠视网膜副凋亡和自噬的发生


    视网膜缺血再灌注损伤（retinal ischemia reperfusion injury，RIRI）是青光眼、糖尿病视网膜病变及其他相关眼病共同的病理基础，可导致视功能的损害并最终致盲^［1］。青光眼是全球导致失明的主要原因之一，属于神经退行性疾病，以病理性高眼压为特征并导致视网膜缺血和渐进性神经元死亡^［2］。各种类型的程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）参与神经退行性疾病^［3-4］。那么非凋亡形式PCD——副凋亡和自噬是否参与了青光眼急性RIRI大鼠视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）的死亡?本研究利用大鼠急性RIRI模型，探讨非凋亡形式PCD与急性RIRI后RGCs死亡的关系及其作用机制，为预防急性RIRI后RGCs死亡的发生和探索新的治疗途径提供实验依据。
1　材料与方法
1.1　 材料
1.1.1　实验动物与分组　健康成年SD雄性大鼠30只，体质量220～250 g，无眼疾，购自西安交通大学医学院实验动物中心。大鼠随机分为急性RIRI组（24只）及正常对照组（6只）。急性RIRI组按RIRI后不同时间点分为1 d、3 d、7 d、28 d四个小组，每组6只大鼠。各组SD大鼠均在正常温度、湿度、光亮度下生活，定时喂养。正常对照组不做任何处理；急性RIRI组建立急性RIRI模型。实验动物的使用遵循国家实验动物管理保护条例。
1.1.2　主要实验试剂及仪器　兔抗鼠视网膜微管相关蛋白1轻链3（microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3）抗体（日本MBL公司），FITC标记抗兔IgG（北京康为世纪公司），DAPI（美国 Sigma公司）。显微手术器械（苏州66视觉医疗器械厂），透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）（H-7650，日本Hitachi公司），超薄切片机（LKB-Ⅴ/NOVA，瑞典LKB 公司），倒置荧光显微镜（BX51，日本Olympus公司）。
1.2　方法
1.2.1　急性RIRI模型的建立　采用前房灌注生理盐水升高眼压法建立急性RIRI模型（均选择右眼为实验眼）^［5］。80 g·L^-1水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，清洁大鼠头部，盐酸奥布卡因滴眼液行表面麻醉，氯霉素滴眼液消毒眼部。将连接生理盐水滴瓶输液管的4号半针头沿大鼠右眼颞侧角巩膜缘斜刺入前房，液平高度与鼠眼垂直距离为150 cm，造成大鼠眼内110 mmHg（1 kPa=7.5 mmHg）的高眼压，见瞳孔区反光由橘红色变为苍白，眼底镜检查视网膜苍白，说明已完全阻断视网膜中央动脉供血。高眼压状态持续60 min后拔出输液针头，可见瞳孔区反光迅速变为暗红色，视网膜呈橘红色，说明阻断的血管重新开放，已形成再灌注。术中保持大鼠体温37 ℃，术后给予红霉素眼膏涂眼预防感染。
1.2.2　电镜标本的取材及处理　正常对照组取3只大鼠，RIRI组分别于急性RIRI后1 d、3 d、7 d、28 d各取3只大鼠，深度麻醉，经左心室快速灌注4 ℃预冷的生理盐水，随即灌入体积分数2.5%戊二醛+40 g·L^-1多聚甲醛固定液200 mL，先快速滴注至大鼠四肢抽搐，待抽搐停止后，缓慢滴注20 min后取材。取视网膜组织块，浸泡于体积分数2.5%戊二醛+40 g·L^-1多聚甲醛固定液中后固定2~4 h，磷酸缓冲液漂洗，10 g·L^-1四氧化锇固定液4 ℃后固定2~3 h，乙醇梯度脱水，环氧树脂Epon 812浸透、包埋；聚合后做半超薄切片1~2 μm，染色后光学显微镜下定位，超薄切片机行80 nm超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅染色后，TEM下观察、拍照。每例标本检测10个视野。
1.2.3　免疫荧光染色标本的取材　正常对照组取3只大鼠，RIRI组分别于急性RIRI后1 d、3 d、7 d、28 d各取3只大鼠，深度麻醉，经左心室快速灌注4 ℃预冷的生理盐水200 mL，随即灌入40 g·L^-1多聚甲醛500 mL，快速滴注至大鼠四肢抽搐，待抽搐停止后，缓慢滴注2 h后取材。取双眼眼球，置于40 g·L^-1多聚甲醛溶液中后固定24 h，梯度蔗糖溶液脱水至眼球沉于体积分数30%蔗糖溶液底部，制作厚度12 μm的冰冻切片，用于LC3免疫荧光染色。
1.2.4　LC3免疫组织化学检测　切片以0.01 mmol·L^-1 PBS冲洗，体积分数0.03% TritonX-100室温放置30 min；PBS冲洗，体积分数5％山羊血清封闭，室温孵育30 min，滴加兔抗LC3（1∶500）一抗孵育，4 ℃过夜；PBS冲洗，滴加FITC标记的小鼠抗兔lgG（1∶200）二抗室温孵育2 h；PBS洗涤；DAPI染色，室温孵育10 min，PBS冲洗；缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察、照相；阴性对照采用体积分数5％正常山羊血清代替一抗，其余步骤同上。于倒置荧光显微镜下观察自噬的发生及变化。为避免实验过程中非特异性染色造成的误差，每例标本检测3张切片，每张切片检测5个视野。定量评价急性RIRI损伤引起RGCs的丢失程度，每组随机选取5张切片，计数距视盘边缘100 μm处两侧RGCs层200 μm长度内RGCs的数量。
1.3　统计学方法　数据均以均数±标准差表示，应用SPSS 18.0进行数据分析，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行显著性检验，多组间两两比较采用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　急性RIRI后副凋亡的超微结构特征　TEM下正常对照组RGCs偶见核周出现细胞内空泡（图1A-图1B）。副凋亡的典型特征是细胞质空泡化，空泡内清晰且无细胞质。RIRI组RIRI后1 d，RGCs细胞质空泡化明显，但伴随着同时发生的坏死状形态。随RIRI时间的延长，RGCs细胞质空泡化持续出现，再灌注损伤引起RGCs的内质网和（或）线粒体渐进性肿胀，线粒体嵴出现扩张（图1C-图1H）。这些观察结果符合副凋亡的特征^［6-7］。因此，急性RIRI可部分通过副凋亡途径诱导RGCs死亡。RIRI导致细胞器的肿胀可能提示细胞内环境稳态的破坏。
2.2　急性RIRI后自噬的超微结构特征　TEM示，正常对照组RGCs细胞质中偶见自噬体（图2A-2B），每50 μm²平均为0.79个。急性RIRI后1 d，RGCs细胞质中已经可见自噬体的激活，并在整个实验期间持续激活（图2C-图2H）。急性RIRI后7 d自噬体的平均数量达到高峰，每50 μm²平均为2.29个，与正常对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。自噬激活的表现为自噬体包裹损伤的线粒体或自噬泡包裹部分降解的膜性物质。这些结果表明，急性RIRI损伤的病理机制涉及RGCs自噬的激活。





2.3　LC3在急性RIRI后视网膜中的表达　LC3免疫荧光法检测急性RIRI后1 d、3 d、7 d、28 d及正常对照组RGCs自噬的激活情况。正常对照组LC3免疫荧光染色（绿色）存在于RGCs层和内丛状层（图3A）。阴性对照未检测到LC3免疫荧光染色。LC3免疫反应性在急性RIRI后1 d的RGCs层和内丛状层显著增加，表现为小簇状、致密染色颗粒，并在整个实验期间持续高表达（图3）。急性RIRI后7 d，内丛状层的LC3免疫反应性降低。正常对照组RGCs层的LC3阳性细胞百分比为15.90%，RIRI后1 d LC3阳性细胞百分比显著增高，达到46.95%，与正常对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。急性RIRI后28 d LC3阳性细胞百分比仍高达到52.30%，与正常对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）（图3E）。以400倍的放大率对RGCs层的DAPI阳性细胞数（蓝色）进行计数，正常对照组每200 μm为（11.1±1.27）个，而急性RIRI后28 d DAPI阳性细胞的数量下降到每200 μm（8.57±1.72）个，与正常对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）（图3F）。急性RIRI后7 d内丛状层和内核层的厚度显著下降并持续至28 d，这反映了视网膜内层结构的破坏。
3　讨论
    RIRI是青光眼、糖尿病视网膜病变及其他相关眼病的共同病理基础^［1］。青光眼是全球导致失明的主要原因之一，属于视神经的神经退行性疾病，最终会导致不可逆性视功能损害^［1-2］。越来越多的证据表明，各种类型的PCD，如细胞凋亡和自噬作用，在青光眼患者和哺乳动物模型的青光眼性视网膜损伤中发挥重要作用^{［5，7-8］}。更好地了解每种PCD的分子机制，并选择性阻止这些类型的PCD可能对神经元的存活和视功能的保留有益。
    本研究结果表明，大鼠急性RIRI模型中，副凋亡和自噬的激活与RIRI引起的视网膜损伤相关。本研究证实急性RIRI可诱导RGCs细胞质中不规则的空泡形成。对细胞质空泡化的进一步观察表明，其与内质网和（或）线粒体肿胀相关并伴随核染色质的保存。这些结果表明，急性RIRI诱导的细胞质空泡化可能与副凋亡相关，并可能导致副凋亡样细胞死亡。肿胀的内质网和线粒体已涉及到细胞内环境稳态的破坏^［9］。副凋亡是一种新近定义的PCD，目前对其发生的机制知之甚少，国内外学者正努力鉴别特定副凋亡样变化，但仅在过去的几年中才有研究对其蛋白质组学分析进行描述^［10-11］。副凋亡在神经系统发育的细胞分化阶段及许多神经变性疾病中发生^［12］。近年来，许多研究强调神经元对涉及副凋亡过程的应激相关信号的损伤易感性，这加强了副凋亡和神经退行性疾病之间的联系^［7，13］。
    免疫组织化学检测结果和TEM的观察结果表明，与正常对照组比较，急性RIRI后RGCs自噬活性明显增加。急性RIRI后不同时间点，通过TEM可观察到双层或多层膜嗜酸性自噬囊泡的超微结构特征。TEM观察到包裹细胞质结构的双层膜囊泡是验证自噬体产生的金标准。在大鼠急性RIRI模型中，RGCs层涉及伴随神经退行性变性发生的自噬持续性激活。免疫荧光染色结果显示，急性RIRI后1 d RGCs层的LC3表达增加，并在整个实验期间持续高表达。急性RIRI后3 d RGCs丢失显著，而RGCs细胞质中LC3免疫反应性显著增加。RGCs细胞质中LC3高表达与RGCs显著丢失的时期相对一致。然而，LC3反应性的增加并非自噬特异性。此外，除了在自噬中起到重要作用外，最近有文献报道，LC3还涉及非自噬性细胞质空泡化^［14］。自噬在急性RIRI的视网膜激活增加可能代表受损物质再循环和导致细胞死亡两种机制。根据不同的细胞环境，自噬作为真核细胞中的溶酶体介导的自我降解过程，既可以促进存活，也可进行性恶化并最终导致细胞死亡^［7，15］。
    本研究结果表明，急性RIRI可诱导三种类型的PCD，副凋亡、自噬和凋亡在RGCs同时发生。在以往的研究中，Kim等^［16］发现急性高眼压与RGCs细胞死亡和细胞存活途径的多种变化相关联。最近的研究发现，PCD可作为单一细胞死亡的形式，也可与副凋亡、自噬、细胞凋亡等多种细胞死亡形式共存，参与缺血性损伤、神经退行性变性和病毒感染^{［11，17-18］}。
    综上所述，我们的研究结果不仅证实之前的报道，即细胞凋亡引起急性RIRI后RGCs的死亡，同时也表明，副凋亡和自噬的失调可能参与了急性RIRI导致的RGCs死亡。新的共识认为副凋亡和自噬是一把双刃剑，既可参与促进存活的机制，也可进行性恶化并最终导致细胞死亡。多种微环境的改变，可能会激活副凋亡和自噬的其中一种或多种生化途径。在青光眼及其他神经退行性疾病中，无论是通过抑制或增强，靶向干预副凋亡和自噬，可能是神经系统疾病治疗性干预的潜在目标。