《眼科新进展》  2018年5期 425-429   出版日期：2018-05-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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生姜提取物对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠晶状体的保护作用


目前，全球约有2.85亿糖尿病患者，预计到2030年，其全球患病率将达到7.7%（约4.39亿）^［1］。糖尿病性白内障作为糖尿病患者第二大眼部并发症，已经严重影响到患者生活质量。目前手术仍然是唯一有效的治疗方法，但此类患者在术中、术后可能存在更多问题。如术后感染、切口愈合延迟、眼表损伤进一步加重、术后角膜以及黄斑水肿等。因此，寻找有效的非手术方法来延缓糖尿病性白内障进展十分必要。目前，国内外学者正着力从细胞、蛋白、基因等层面开辟有效治疗糖尿病性白内障的非手术方法。生姜提取物具有抗癌、抗凝血、抗炎、止吐、镇痛等作用，其根茎中提取的单环半萜类化合物与某些类黄酮物质互为同分异构体^［2-3］。本实验主要通过对链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的糖尿病大鼠进行不同浓度的生姜提取物干预处理，明确生姜提取物是否对糖尿病大鼠晶状体具有保护作用。
1　材料与方法
1.1　实验动物　SPF级SD大鼠［许可证编号：SYXK（川）2013-065］60只，雄性，体质量为180～200 g，7周龄，由西南医科大学医学动物中心提供，苦味酸标记，适应性喂养7 d后造模。
1.2　方法
1.2.1　动物模型的建立　雄性SPF级SD大鼠60只，随机分为A组（正常对照组）、B组（糖尿病组）、C1组（糖尿病+生姜提取物灌胃50 mg·kg^-1组）、C2组（糖尿病+生姜提取物灌胃100 mg·kg^-1组）、C3组（糖尿病+生姜提取物灌胃300 mg·kg^-1组），每组12只。B、C1、C2、C3组大鼠腹腔注射65 mg·kg^-1 STZ建立糖尿病动物模型，A组注射等体积的生理盐水。以72 h后空腹血糖>16.7 mmol·L^-1为成模标准，成模后给予大鼠相应浓度的生姜提取物灌胃，每天一次，A、B组大鼠生理盐水灌胃，每天一次。每周观察大鼠血糖与晶状体变化情况，并于造模后4周、8周、12周分批处死大鼠并立即取出晶状体，ELISA检测晶状体醛糖还原酶（aldose reductase，AR）含量；Western blot检测糖基化终末产物（glycosylation end products，AGEs）表达；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性测定试剂盒检测SOD活性，丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量测定试剂盒检测MDA含量；TUNEL法检测晶状体上皮细胞（lens epithelial cells，LECs）凋亡率，扫描电镜观察晶状体超微结构变化。
1.2.2　大鼠晶状体混浊的分级标准　参考牛津大学眼科实验室分级标准^［4］：0期，晶状体透明；Ⅰ期，轻度混浊，周边皮质出现少量囊泡，瞳孔区保持透明；Ⅱ期，中度混浊，囊泡增多，周边囊泡融合，少量扩展至瞳孔区皮质，晶状体核区出现轻度絮状混浊；Ⅲ期，高度混浊，瞳孔区皮质大量囊泡，核混浊区显著加重；Ⅳ期，晶状体完全混浊。
1.2.3　晶状体上皮细胞荧光TUNEL染色　石蜡切片脱蜡、水化后，滴加蛋白酶K工作液37 ℃作用15 min，PBS洗涤3次，每次5 min；滴加破膜工作液，室温10 min，PBS洗涤3次，每次5 min；将试剂1 （TdT） 和试剂2（dUTP）按体积比1∶9充分混合，37 ℃水浴60 min；PBS清洗后加入DAPI，暗室下常温5 min，PBS漂洗3次，每次5 min，用含抗荧光淬灭封片剂的玻片封片，荧光显微镜下观察并拍照。
1.2.4　Western blot 检测晶状体AGEs表达　预冷PBS 漂洗标本，剪碎组织，加入10倍组织蛋白提取试剂，冰浴30 min，4 ℃ 12 000 r·min^-1离心5 min，收集上清，即为总蛋白溶液。BCA试剂盒测定待测样品中蛋白浓度后，依次行SDS-PAGE电泳、转膜、抗体孵育、发光检测。
1.2.5　SOD活性与MDA含量测定　生理盐水反复冲洗晶状体并吸干水分。冰浴下制备组织匀浆后，4 ℃ 3000 r·min^-1离心10 min，取上清液，用生化测定法分别采用SOD和MDA试剂盒进行检测^［5］。
1.2.6　ELISA法检测晶状体AR含量　按试剂盒使用说明进行操作。450 nm处空白对照调零后测每孔吸光度（A）值。横坐标为标准品浓度，纵坐标为A值，将各标准品的坐标点连线，绘制成标准曲线，根据待测标本的A值在曲线上查找对应浓度，并乘以稀释倍数后得出相应浓度。
1.2.7　扫描电镜观察晶状体纤维形态变化　PBS反复清洗样本后，体积分数分别为30%、50%、70%、80%、90%的乙醇梯度脱水各15 min，无水乙醇脱水3次，每次15 min。叔丁醇置换3次，每次30 min。冷冻干燥仪干燥样品。用导电胶带将样品粘到样品台上。镀膜：用离子溅射仪给样品镀10 nm金膜后上机。
1.3　统计学分析　本实验数据均采用SPSS 17.0进行统计学分析，所有数据均符合正态分布，计量资料以均数±标准差表示，多组样本均数之间的比较采用单因素方差分析；各组内不同时间段样本均数的比较采用重复测量的方差分析；组间两两比较采用LSD法或独立样本t检验；组内两样本均数采用配对t检验，等级资料用Kruskal-Wallis H秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　大鼠空腹血糖水平　A组大鼠血糖无明显改变。B组大鼠血糖呈逐渐上升趋势，与A组相比差异有统计学意义（P=0.000）。成模后4周、8周时，B组与C1、C2、C3组间血糖变化比较差异均无统计学意义（均为P>0.05）；成模后12周时，B组与C1、C2、C3组间血糖变化比较，差异有统计学意义（P=0.018）。C1、C2、C3组大鼠空腹血糖呈缓慢下降趋势，该变化在C3组中差异有统计学意义（P=0.029）；见表1。



2.2　大鼠晶状体混浊变化　A组大鼠晶状体始终透明。成模后4周时，B组大鼠晶状体混浊情况同C1、C2、C3组比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）；C1组同C2、C3组晶状体混浊改变比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）。成模后8周时，B组与C2、C3组，C1组与C3组，C2组与C3组的晶状体混浊情况比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）；见表2。



2.3　大鼠晶状体SOD活性、MDA含量变化　成模后4周、8周、12周时，糖尿病大鼠晶状体SOD活性呈下降趋势，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；且不同时期，C1、C2、C3组大鼠晶状体SOD活性差异均有统计学意义（均为P<0.05）。B、C1组随时间变化MDA含量呈明显上升趋势（均为P<0.05）。成模后4周时，仅B、C3组MDA含量变化差异有统计学意义（P=0.019）。成模后8周时，各组MDA含量差异均有统计学意义（P=0.000）；除C1、C2组外，各组间MDA含量比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）。成模后12周时，除C2、C3组外，各组间MDA含量比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）；见表3-表4。
2.4　大鼠晶状体AR含量变化　B组大鼠AR持续性增高（P=0.003）。C1、C2、C3组大鼠晶状体AR含量呈下降趋势，差异均有统计学意义（P=0.007、0.000、0.000），但仍显著高于A组。B、C1、C2组大鼠成模后8周与12周的晶状体AR含量变化差异均有统计学意义（均为P<0.05），而C3组的AR含量变化差异则无统计学意义（P=0.473）。见表5。





2.5　大鼠晶状体AGEs表达变化　A组大鼠晶状体AGEs表达含量同各组比较为最低，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。B组大鼠晶状体AGEs表达含量同各组比较为最高，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。成模后4周、8周、12周时，C1、C2、C3组大鼠晶状体AGEs表达情况差异均有统计学意义（均为P<0.05；见图1）。
2.6　大鼠晶状体超微结构的变化　A组大鼠晶状体浅层皮质区纤维排列整齐，纤维粗细均匀，指状突起沿长轴规则排列（图2A）；皮质深层纤维致密，呈索状外观（图2B）。B组大鼠成模后4周时浅层皮质区晶状体部分纤维完全断裂，明显水肿，指状突起混乱，形态不规则（图2C）；12周时可见大鼠晶状体皮质区纤维排列杂乱无章，结构难以辨认（图2D）。C1组大鼠成模后4周时皮质区晶状体纤维紊乱，指状突起数量减少，部分纤维撕脱、断裂（图2E）；12周时浅皮质区纤维卷曲、断裂，指状凸起错乱，部分纤维肿胀（图2F）。C2组成模后8周时浅皮质区晶状体纤维表面稍粗糙，部分纤维缺失，指状突起基本沿晶状体长轴排列（图2G）；12周时纤维粗细不均，部分纤维断裂、脱失（图2H）。C3组大鼠成模后4周时可见纤维基本规则，少量缺失，指状突起形态较规则（图2I）；12周时可见部分纤维轻度肿胀，指状突起清晰可见（图2J）。




2.7　大鼠LECs凋亡情况　A组大鼠LECs凋亡率随时间变化差异无统计学意义（P=0.191）。其余大鼠LECs的凋亡率呈现上升趋势，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。整个实验期间，B、C1、C2、C3组大鼠LECs凋亡率差异均有统计学意义 （均为P<0.05；见表6）。



3　讨论
    Ojewole^［6］予以STZ诱导的1型糖尿病大鼠口服生姜提取物，降血糖效应为24%~53%。Rani等^［7］发现，生姜可促进葡萄糖的摄取以及刺激葡萄糖转运蛋白-4的表达，抑制蛋白糖基化。Shanmugam等^［8］给予正常和糖尿病大鼠生姜灌胃30 d后发现，糖尿病大鼠血糖显著下降，而正常组大鼠血糖无明显改变。本实验发现，随病情进展，高浓度生姜灌胃组（C3组）大鼠空腹血糖下降程度较为显著，降血糖幅度最大，约24%。与上述研究结果相似。生姜提取物可降低五羟色胺受体敏感性，提示其降低血糖机制可能与此有关。长期口服生姜提取物的糖尿病大鼠的血浆葡萄糖水平曲线更低，但胰岛素曲线明显上升^［9］。生姜提取物可影响五羟色胺受体通道系统，抑制Na⁺、K⁺、Ca⁺通道开放，减少细胞膜去极化，从而降低胰岛素释放阈值、增加骨骼肌组织对葡萄糖的摄取^［10］。
    Lupachyk等 ^［11］发现糖尿病性白内障晶状体前囊膜细胞凋亡比例为5%～40%，正常晶状体前囊膜几乎无细胞凋亡产生。本实验发现，B组LECs凋亡率可达64%。我们早期研究发现，糖尿病大鼠LECs凋亡率均可持续性上升，与晶状体混浊程度呈正相关^［12］。血糖浓度超过阈值，己糖激酶活性饱和，葡萄糖进入山梨醇途径，造成晶状体渗透压的改变，从而引起白内障^［13-15］。山梨醇以微摩尔级的浓度存在，但足以影响糖尿病患者晶状体渗透压^［16］。研究表明，AR在糖尿病大鼠晶状体中含量持续性升高，其混浊程度与AR含量呈负相关。本实验发现，经不同浓度的生姜灌胃后大鼠晶状体AR含量缓慢下降，而以C3组下降最为明显^［17-18］。
    本实验中糖尿病大鼠SOD活性呈持续性降低趋势，而MDA含量则随时间推移而表现为持续性上升，此趋势在一定程度上表明了其发生发展与氧化损伤的关系。不同浓度的生姜提取物灌胃后，SOD活性随浓度增加而增高，MDA含量随浓度增加而降低，表明脂质过氧化反应在一定程度上被抑制。Franke等^［19］发现人LECs有表达AGE受体的mRNA大量存在，提示AGEs可能可以诱导内皮细胞与纤维化相关基因和蛋白质。本实验发现，A组大鼠晶状体AGEs表达含量较低，B组大鼠AGEs含量最高。随着灌胃浓度的增加，晶状体AGEs表达情况呈缓慢下降趋势，且晶状体混浊程度呈下降趋势。本实验发现生姜提取物对糖尿病大鼠晶状体存在一定保护作用，具体机制有待进一步研究。生姜提取物作为一种混合物，如能进一步明确其药效动力学、药代动力学、组织毒力、最佳浓度、最佳剂型、最佳药物配比等方面性质，则有望给糖尿病性白内障患者的药物治疗提供新的思路。