《眼科新进展》  2018年5期 407-411   出版日期：2018-05-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
高糖抑制角膜缘干细胞间质性及其迁移能力的研究


糖尿病角膜病变是一种潜在性的致盲性眼病，常导致角膜上皮功能异常，进而引起角膜上皮创伤修复延迟以及上皮屏障功能减退［1］。Schultz等［2］认为，47%~64%的糖尿病患者在其一生中可能出现糖尿病角膜病变，其临床表现为反复的上皮糜烂、上皮再生迟缓、持续性上皮缺损、浅层角膜溃疡等。近年关于糖尿病角膜上皮细胞病变的研究在国内外都引起了一定的关注，但其发病机制并未完全阐明。角膜缘干细胞作为一种成体干细胞，在角膜上皮创伤时发生活化、增殖，分化成基底细胞，并向创伤区发生定向迁移，基底细胞可再分化成角膜上皮各层细胞，修复受损的角膜上皮［3］。有研究证实，当发生糖尿病角膜病变时，角膜上皮基底层细胞空泡形成，基底层细胞退化甚至凋亡，细胞间隙增大，出现裂缝，细胞间连接疏松，桥粒数量减少，基底膜细胞外基质合成异常［4］。本研究通过模拟角膜缘干细胞高糖环境，探讨高糖引起的角膜缘干细胞增殖及迁移功能改变，并探究其表面分子标志（β-catenin、vimentin）对细胞功能及状态的影响。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验动物及分组　将人角膜缘干细胞分别采用高糖培养基和正常培养基进行传代培养，分为两组：高糖组（葡萄糖浓度为25 mmol·L-1）和对照组（葡萄糖浓度为5 mmol·L-1）。取雌性成年大鼠30只（SPF级，广东省医学实验动物中心提供），体质量170~230 g，无眼部疾病及全身疾病。采用随机数字表法分为两组，糖尿病组16只和对照组14只。
1.1.2　试剂与仪器　胎牛血清、DMEM F12培养基、台盼蓝溶液（美国Gibco公司）；RNAiso Plus提取试剂盒、PrimeScript反转录试剂盒、SYBR Green Premix Ex Taq荧光定量PCR试剂盒（日本TAKARA公司）；链脲霉素（Sigma）；荧光素钠注射液（美国Alcon公司）；抗Vimentin抗体、抗β-catenin抗体（CST）；荧光二抗（Invtrogen）；光学显微镜（日本奥林巴斯公司）；HE全自动染色剂（德国Microm公司）；荧光定量PCR仪（美国ABI9700）；紫外分光光度计（美国NanoDrop/ND-2000）。
1.2　方法
1.2.1　β-catenin和vimentin的mRNA及蛋白表达检测　待两组细胞在培养皿中长至融合，分别分组离心收集，细胞数约为3×106个，采用Trizo Reagent法提取细胞总RNA。紫外分光光度计定量后，取1000 ng RNA，逆转录后采用两步法进行实时荧光定量PCR反应，重复检测3次，并进行统计分析。β-catenin上游引物：5’-GCTTACCTTGACCCCAACTTG-3’、下游引物：5’-ACGTTCCATACCAGTACCCAG-3’；vimentin上游引物：5’-GACGCCATCAACACCGAGTT-3’、下游引物：5’-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3’；PCNA上游引物：5’-GCGTGAACCTCACCAGTATGT-3’、下游引物：5’-TCTTCGGCCCTTAGTGTAATGAT-3’。
    收集高糖组和对照组细胞，收集蛋白样品后用BCA蛋白浓度测定法测定蛋白浓度。两组蛋白进行80 g·L-1 SDS-PAGE电泳，PVDF膜进行转膜，脱脂奶粉封闭后加入一抗孵育于4 ℃冰箱过夜。第2天二抗孵育2 h后，于凝胶图像处理系统显影并分析目标带的相对分子质量。所用一抗分别为vimentin（1∶1000）、β-catenin（1∶1000）、β-actin（1∶1000）。
1.2.2　角膜缘干细胞表面分子标志的定位（细胞免疫荧光检测）　在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗后用40 g·L-1多聚甲醛固定15 min，5 g·L-1 Triton X-100室温透膜，山羊血清封闭后滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4 ℃孵育过夜；第2天滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20~37 ℃孵育1 h，DAPI复染核，再用抗荧光淬灭剂封片，在荧光显微镜下观察采集图像。所用一抗为vimentin（1∶100）、β-catenin（1∶100），荧光二抗（1∶100）。
1.2.3　角膜缘干细胞的增殖功能检测　角膜缘干细胞的增殖检测采用CCK8法。以15×103 mL-1活细胞接种于96孔板，每孔加入200 μL（即每孔活细胞约3000个），各组均设置6个复孔，高糖组和对照组分别接种24 h、48 h及72 h组。按培养时间取各组细胞每孔加入10 μL CCK-8溶液在培养箱中孵育30 min后，用酶标仪在450 nm处测量吸光度（A）值。计算细胞存活率［增殖率=（高糖组A值-空白对照A值）/（高糖组0 h时A值-空白对照A值）］，并绘制细胞增殖曲线。
1.2.4　角膜缘干细胞的迁移功能检测　纵向迁移能力采用Transwell实验观察。将2组细胞以15 000个·mL-1接种于Transwell孔中，上室分别加入无血清高糖培养基和无血清正常培养基100 μL，下室加入600 μL完全培养基，置37 ℃、含体积分数5% CO2培养箱内培养48 h后，洗去上室残留细胞，染色并拍照，随机拍5个视野，用ImageJ软件对图片进行细胞计数，并对数据进行统计分析。
    横向迁移能力采用划痕实验分析。2组分别取500×103个细胞接种于6孔板中，培养24 h待2组细胞均达到80％～90%融合后，以200 μL移液器枪头在培养板每孔的中央沿垂直于横线方向划一直线。向每孔中加入含体积分数1%血清的培养基置37 ℃、含体积分数 5%CO2培养箱中培养，在培养后0 h、24 h及48 h倒置显微镜下观察划痕处的细胞生长情况并随机选择5个视野拍照。计数2组细胞，并对数据统计分析。
1.2.5　高糖高脂糖尿病大鼠模型的构建　饲养及实验过程均符合ARVO有关动物研究的相关规定。糖尿病组饲养第3天按30 mg·kg-1腹腔注射20 g·L-1链脲霉素溶液，第18天按40 mg·kg-1腹腔追加注射20 g·L-1 STZ溶液，第32天喂高脂饲料至实验结束。对照组大鼠14只饲养第3天、第18天和第32天腹腔注射等体积生理盐水，并饲喂正常饮食至实验结束。
    监测指标：每天观察大鼠精神状态、摄食、饮水量及尿量情况，在饲养第3天及第1周、3周、9周、12周称取所有小鼠体质量，尾静脉采血测空腹血糖。
1.2.6　HE染色及免疫组织化学染色检测角膜组织间质性相关分子表达　取刮除角膜上皮后48 h的大鼠，颈椎脱臼法处死大鼠，取大鼠右眼角膜缘组织用100 g·L-1多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋后连续切片，脱蜡复水后行HE染色后在光学显微镜下用100倍镜观察并采集图像。糖尿病组和对照组大鼠取眼球后固定于100 g·L-1多聚甲醛溶液中24 h后石蜡包埋，切片后置入柠檬酸抗原修复液中高温修复，再用体积分数3% H2O2封闭过氧化物酶10 min，滴加山羊血清封闭30 min，加入一抗（β-catenin、vimentin）（1∶200用抗体稀释液稀释）于37 ℃水浴60 min，二抗室温孵育30 min，Mayer苏木素复染2 min，晒干封片后光学显微镜下观察并拍照。
1.3　统计学分析　本实验数据使用SPSS 19.0软件进行统计学分析及统计图绘制。组间比较采用t检验进行差异性分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　高糖对角膜缘干细胞增殖及间质性标志的影响　高糖组培养的细胞在培养24 h、48 h及72 h增殖率分别为0.728、0.345及0.395，较对照组明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；Western-blot结果提示，高糖可抑制角膜缘干细胞表面分子标志vimentin和β-catenin蛋白表达；同时，vimentin和β-catenin的mRNA表达也有所降低（图1）。两组的免疫荧光实验证实，对照组的β-catenin蛋白定位于细胞核，而高糖组定位于细胞质，细胞核内极少（图2）。




2.2　高糖对角膜缘干细胞迁移的影响　高糖组角膜缘干细胞在48 h后仍未迁移覆盖划痕，且在24 h时，划痕呈现扩大趋势。48 h时对照组迁移率为100%，高糖组为17.6%，差异有统计学意义（P<0.05）。Transwell实验结果证实对照组角膜缘干细胞在48 h后可通过溶解细胞基质进行y轴纵向迁移运动，且大部分可迁移至纤维膜的另一面，而高糖组培养的角膜缘干细胞仅极少数可发生变形迁移，且迁移后细胞形态各异，细胞状态较差（图3）。



2.3　糖尿病大鼠的造模　造模前对照组和糖尿病组大鼠血糖浓度均为5.4~6.8 mmol·L-1，造模1周后糖尿病组大鼠活动较前减少，食量、饮水量及尿量较对照组明显增多，逐渐出现体质量减轻、免疫力下降等表现。对照组大鼠12周时血糖浓度为（6.1±0.6）mmol·L-1，糖尿病组大鼠在12周时血糖浓度稳定于（21.9±4.3）mmol·L-1。
2.4　大鼠角膜HE染色　HE染色结果显示，对照组角膜上皮层结构清晰，由3~5层表层上皮、3~4层翼状上皮及底层高柱状基底细胞层组成，细胞排列紧密整齐。而糖尿病组角膜上皮明显变薄，表层上皮缺失或仅残留1层，翼状上皮细胞形态各异、细胞连接疏松、排列紊乱，基底细胞层细胞失去其原有高柱状细胞形态，细胞变小，呈多边形或短柱状，排列紊乱（图4）。



2.5　大鼠角膜免疫组织化学染色　免疫组织化学染色结果显示，对照组大鼠角膜基底细胞层可见vimentin和β-catenin蛋白高表达，而表层上皮和翼状上皮层表达量极低；而糖尿病组角膜基底细胞的vimentin和β-catenin蛋白表达明显降低，其表达量与表层上皮和翼状上皮层类似（图5）。



3　讨论
    糖尿病角膜病变的患者在经受眼部创伤或内眼手术后，常发生持续性的角膜上皮剥脱和复发性角膜溃疡［5］。作为一种潜在性的致盲性疾病，至今仍无针对其发病机制的治疗药物，如何有效防治糖尿病角膜病变已成为近年研究的热点和难点［6］。高糖环境可通过激活线粒体通路或还原型辅酶2（NADPH）氧化，使细胞发生氧化应激，进而促进细胞凋亡［7-8］。在本实验中，与对照组细胞比较，高糖组培养的人角膜缘干细胞在24 h时即出现明显的细胞凋亡增加，其存活率随着时间增加而进一步下降。Saika等［9］研究发现当角膜上皮层创伤后，基底膜发生短暂的解聚，基底细胞在细胞因子的指引下，向创伤区域迁移，并逐渐增殖、分化。因而基底细胞的迁移与增殖能力对于角膜上皮的创伤愈合至关重要。本研究通过在Transwell小室底部铺设人工基底膜并结合划痕实验模拟角膜缘干细胞的纵向和横向迁移。本研究发现，高糖引起角膜缘干细胞纵向迁移能力明显降低，细胞溶解基底膜以及变形能力减弱，且发生迁移后较难维持正常的细胞形态，易于脱壁，进而发生凋亡。当对照组角膜缘干细胞在接受划痕损伤后，即发生迁移运动，在48 h时创伤区已完全被角膜缘干细胞所覆盖。而高糖培养的角膜缘干细胞未能在48 h迁移修复创伤区域，并在24 h时出现创伤区域的进一步扩大。以上实验说明高糖可影响角膜缘干细胞的迁移和变形功能，并降低其基质溶解能力。
    本实验使用链脲霉素诱导大鼠发生1型糖尿病，造模后大鼠血糖明显高于正常，毛发无光泽，嗜睡、活动减少，出现多饮、多食及多尿等类似人类糖尿病的全身表现。在刮除了正常大鼠的角膜上皮后，未使用生长因子药物的情况下，上皮可在48 h内愈合，且不留瘢痕。而糖尿病组大鼠的上皮创伤后角膜上皮愈合缓慢，且在24 h时创伤区几乎较前比较无明显变化，48 h后创伤区仅少部分修复中央区域角膜上皮全层缺失。48 h后处死大鼠，取对照组和糖尿病组大鼠角膜作HE染色，可见对照组大鼠角膜层次清晰，细胞排列整齐有序，上皮细胞层与翼状细胞层细胞粘连紧密，基底细胞层细胞较大呈高柱状，核较大细胞呈激活态，细胞排列整齐，与前弹力层间可见一层淡染的基质层，细胞与基质层间粘连紧密；糖尿病组上皮层细胞稀疏排列紊乱，表层上皮部分或全部缺失，基底细胞层细胞减少，细胞呈圆形或椭圆形，细胞核染色较深、核固缩。角膜基底层细胞由角膜缘干细胞分化而成［10］，与角膜缘干细胞形态及功能类似，可进一步分裂分化，并分泌细胞因子维持基底膜结构和眼表微环境［10］。vimentin和β-catenin作为中间丝蛋白，在细胞骨架的构成和调节细胞增殖和迁移中起到重要作用［11］。在角膜上皮组织中，这两种分子作为间质细胞的标志，主要表达于角膜缘干细胞和基底细胞，而在翼状细胞和表层上皮细胞中表达量极低或不表达［12］。有研究显示，vimentin可促进角膜缘干细胞向“杯状”变形，进而易于接受炎性因子等因子并向创伤区域趋化、迁移［13-14］，而vimentin本身也可促进炎性细胞如白细胞和淋巴细胞的迁移，并进一步促进角膜缘干细胞的迁移［15］。本实验通过角膜免疫组织化学探究vimentin和β-catenin在角膜基底细胞层的表达。vimentin在正常大鼠中主要表达于基底细胞细胞质中，β-catenin可见部分细胞核内表达，余上皮层表达极少。而糖尿病大鼠的角基底细胞层vimentin和β-catenin表达明显降低，免疫组织化学染色呈浅褐色或几乎不着色。细胞质内的β-catenin有两种代谢方式［16］：（1）形成“破坏复合体”，经蛋白酶体降解；（2）向细胞核内发生转移后，可通过经典WNT/β-catenin通路，促进细胞增殖。本研究发现当发生角膜上皮创伤后，角膜缘干细胞细胞和基底细胞核内β-catenin蛋白浓度显著增高，且其mRNA转录增加，细胞核内高浓度的β-catenin可加快细胞周期、促进细胞增殖，这可能与创伤后角膜缘干细胞和基底细胞在创伤中被激活有关。同时发现高糖环境下，角膜缘干细胞和基底细胞的β-catenin蛋白和mRNA较对照组明显降低，体内和体外实验均发现细胞增殖缓慢而凋亡增加，可能与高糖导致的β-catenin合成异常或破坏复合体形成增多有关。
    综上所述，糖尿病角膜病变作为一个以角膜上皮创伤愈合延迟和上皮反复剥脱为特征的疾病，角膜缘干细胞在其中发挥着核心作用［17］。持续性的角膜上皮剥脱和上皮创伤愈合延迟是糖尿病患者角膜外伤或内眼手术后常见的并发症［18］，促进创伤的快速愈合对于减少深层组织的损伤及保持角膜的透明度意义重大［19］。目前临床治疗多基于维持眼表微环境或促表层上皮细胞移行［20］，而基于角膜缘干细胞的治疗研究较少，本实验探讨了角膜缘干细胞在糖尿病中的功能及表面分子标志的改变，以期为临床治疗提供理论基础和治疗思路。