《眼科新进展》  2018年4期 324-328   出版日期：2018-04-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

---

色素上皮衍生因子基因修饰的人脐带间充质干细胞对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤的保护作用


    目前，视网膜缺血再灌注损伤（retinal ischemia-reperfusion injury，RIRI）成为损伤人类视力的重要原因，病情严重或者处置不当将导致患者失明。各种原因导致的RIRI比较多见，这类疾病主要累及视网膜神经节细胞。众所周知，神经细胞是不可逆性细胞，损伤后不可再生，因此患者视力也会受到不可逆性降低。研究表明色素上皮衍生因子（pigment epithelial-derived factor，PEDF）是血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）非特异性抑制剂，不仅具有抑制血管新生的作用，而且具有保护神经的重要作用^［1-5］，在RIRI研究中具有十分广泛的应用前景和重要的研究价值。
1　材料与方法
1.1　材料　脐带间充质干细胞来源于潍坊医学院中心实验室；健康成年雄性SD大鼠48只，体质量180～200 g，购自青岛大任富城畜牧有限公司；PEDF慢病毒载体购自吉凯公司；RT-PCR试剂盒购自日本TOYOBO公司；ELASA试剂盒购自美国Biolegend公司；CD34、CD45、CD43、CD105、HLA-ABC、HLA-DR购自美国CD公司；二氧化碳细胞培养箱购自中国跃进医疗器械公司；RT-PCR仪购自美国Bio-Rad公司；酶标仪购自德国Carl Zeiss公司。
1.2　方法
1.2.1　LV-PEDF-GFP基因重组慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞　转染预实验：取P3代人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs），50×10³ mL^-1接种到96孔板中，培养24 h后，按照吉凯基因慢病毒使用操作手册用感染复数（multiplicity of infection，MOI）值分别为1、10、20、50的PEDF基因重组LV载体的病毒液转染hUCMSCs，荧光显微镜观察绿色荧光表达情况，随机选取5个视野，根据以下公式：转染效率=GFP阳性细胞数/总细胞数×100%，计算平均值。正式感染实验：取P3代hUCMSCs（50×10³ mL^-1）接种到6孔板中，并分成A、B两组，24 h后，A组和B组分别加入最适MOI 值的LV-GFP、LV-PEDF-GFP，保持细胞活性。
1.2.2　RT-PCR检测PEDF-MSCs中PEDF mRNA的表达　设计特异性引物，PEDF上游引物：5’-TTCACCCGGAGCAGTGAT-3’，下游引物：5’-GCCTCCAGAATTGTGTTTGAG-3’；内参基因：上游引物：5’-AACTCCTGTGCGGCTCTGAC-3’；下游引物：5’-TTCCACAATGGCACGCTTCT-3’。然后通过RT-PCR检测A组和B组细胞中PEDF、内参基因的相对表达量，每组设置3个复孔，根据RT-PCR反应曲线得到目的基因和内参基因的Ct值，采用ΔΔCt法进行定量计算，比较两组基因的表达效果，RT-PCR反应条件：95 ℃2 min，95 ℃10 s，60 ℃30 s，70 ℃45 s；共30个循环。
1.2.3　ELISA检测PEDF基因的表达　转染培养3 d后，收集A组与B组hUCMSC细胞培养液，按照PEDF人ELISA试剂盒说明书，稀释样品，然后测定各孔吸光度（A）值，并绘制标准曲线，计算各组PEDF浓度。
1.2.4　大鼠分组　将雄性SD大鼠随机分为正常对照组（N组）、PBS治疗组（PBS组）、人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）治疗组（M组）及 PEDF基因转染的人脐带间充质干细胞治疗组（P组），每组各12只，N组不予特殊处理，其余三组大鼠造模成功后立即进行干预治疗，PBS组给予PBS治疗，P组与 M组分别给予PEDF-MSCs、hUCMSCs治疗。治疗5 d后处死大鼠，右眼为实验眼。
1.2.5　大鼠RIRI模型的建立　SD大鼠常规可乐必妥眼液滴右眼3 d，每天4次，麻醉、散瞳后，将注射器针头自角膜缘刺入前房，避免损伤晶状体和虹膜，瓶高150 cm，可见球结膜苍白，角膜雾浊水肿，视网膜苍白，前房加压灌注过程中确保穿刺针头无松懈脱出，60 min后缓慢拔出针头，角膜逐渐恢复透明，若无感染则为造模成功。
1.2.6　大鼠玻璃体内注射　PBS组、M组、P组大鼠制备RIRI模型成功后立即进行玻璃体内注射，于大鼠鼻上方角膜缘后约2 mm处，45°角进针，PBS组大鼠注射灭菌2 μL PBS，P组注入2 μL（20×10³ μL^-1）LV-PEDF-GFP转染的hUCMSCs悬液，M组注入2 μL（20×10³ μL^-1）hUCMSCs悬液，红霉素眼膏涂眼。
1.2.7　尼氏染色分析　将石蜡切片脱蜡后，放入预热10 g·L^-1甲苯胺蓝中染色40 min，蒸馏水洗3次，体积分数95%乙醇分化，脱色，中性树胶对样本进行封片，镜下观察，距视盘中心1.0 mm范围内测量各组大鼠视网膜厚度，视网膜周边100 μm范围内进行视网膜视神经节细胞计数。
1.2.8　RT-PCR检测大鼠视网膜中PEDF和VEGF的表达　设计特异性引物，VEDF上游引物：5’-CTATGCAGATCATGCGGATCA-3’，下游引物：5’-TATGCTGCAGGAAGCTCATCTC-3’；PEDF上游引物：5’-TTCACCCGGAGCAGTGAT-3’，下游引物：5’-GCCTCCAGAATTGTGTTTGAG-3’；内参基因上游引物：5’-AACTCCTGTGCGGCTCTGAC-3’；下游引物：5’-TTCCACAATGGCACGCTTCT-3’。
    玻璃体内注射5 d后麻醉大鼠，摘取眼球，分离视网膜组织，将600 μL Trizol裂解液加入匀浆器中，将视网膜充分研磨。以β-actin为内参，每份模板的基因重复3次检测，得出溶解曲线和循环阈值（threshold cycles，CT）值，采用2^-△△CT方法计算各目的基因的相对表达量。
1.3　统计学处理　应用SPSS 20.0软件进行统计分析，计量数据均采用均数±标准差表示，所有数据进行方差齐性检验，采用单因素方差分析和两样本均数比较的t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　PEDF-GFP基因重组慢病毒载体在hUCMSCs中的表达　MOI=1组视野中，几乎未见绿色荧光显示（图1A），MOI=10组视野中能观察到少许绿色荧光（图1B），MOI=20组绿色荧光有所增加，与细胞分布相吻合（图1C），MOI=50组绿色荧光最多，视野下可见到大量的绿色荧光，成片状分布（图1D），MOI=50组的转染效率为75.8%。



2.2　RT-PCR检测转染后hUCMSCs中PEDF基因的表达　选取MOI=50时的PEDF转染组和空转染组的细胞，RT-PCR检测结果如下，B组的PEDF mRNA相对表达量为4.34±0.29，A组为1.08±0.15，差异有统计学意义（F=1.60，P<0.05）。
2.3　ELISA检测PEDF蛋白的相对表达量　A组细胞上清液中PEDF蛋白水平为（12.30±1.24）μg·L^-1，B组培养基中为（83.09±7.58）μg·L^-1，说明LV-PEDF转染72 h后，PEDF分泌明显增加，两组相比差异有统计学意义（P<0.01）。
2.4　各组大鼠视网膜内层厚度　N组大鼠尼氏染色显示视网膜神经节细胞层、内核层（inner nuclear layer，INL）、外核层（outer nuclear layer，ONL）呈蓝色，视网膜内层厚度为（108.35±4.22）μm，PBS组大鼠经RIRI 5 d后，视网膜神经节细胞萎缩凋亡，厚度变为（73.26±3.58）μm，与N组大鼠相比，差异有统计学意义（P<0.05；图2A）。P组大鼠经RIRI 5 d后，视网膜厚度为（90.35±4.19）μm，厚于PBS组大鼠，差异有统计学意义（P<0.05；图2B）。M组在造模5 d时，视网膜内层厚度为（82.43±4.29）μm，厚于PBS组，差异有统计学意义（P<0.05），但薄于P组，差异有统计学意义（P<0.05；图3）。




2.5　各组大鼠视网膜神经节细胞数　N组视网膜视神经节细胞数为（8.64±0.27）个。PBS组大鼠经RIRI 5 d后视网膜神经节细胞数减少为（4.12±0.21）个，与N组大鼠相比，差异有统计学意义（P<0.05）。P组大鼠经RIRI 5 d后，视网膜神经节细胞数减少为（5.98±0.23）个，但多于PBS组，差异有统计学意义（P<0.05）。造模5 d后，M组视网膜神经节细胞数多于PBS组，但少于P组，差异均有统计学意义（均为P<0.05；图4）。



2.6　各组大鼠视网膜PEDF及VEGF mRNA的表达　RT-PCR结果显示，P组、M组大鼠的视网膜PEDF mRNA表达均增加，与PBS组相比，差异均有统计学意义（均为P<0.05），P组与M组相比，P组升高更为明显，差异有统计学意义（P<0.05，图5）。M组和P组中VEGF mRNA的表达水平均降低，与PBS组相比，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。P组VEGF表达水平下降更显著，与M组相比差异有统计学意义（P<0.05，图6）。




3　讨论
    RIRI是一种累及视网膜神经细胞的病理生理过程，主要发生在视网膜缺血性疾病中，如视网膜中央动脉阻塞、糖尿病视网膜病变、高眼压等。众所周知，神经细胞损伤后不可再生，所以，RIRI严重影响患者视力，甚至引起视力永久丧失。目前，RIRI的发生发展机制尚不完全明确，可能和多种因素密切相关。Agardh等^［6］在研究RIRI的早期发展过程中，发现大量的炎性因子（TNF-α、白细胞介素-1等）通过各种途径黏附聚集于组织细胞表面，炎性细胞在炎性因子的作用下释放大量的氧自由基分子和酶性物质^［7］，导致视网膜组织损伤，说明RIRI与炎症反应和氧化应激有关。有研究表明，刚出生的大鼠视网膜缺血再灌注后释放大量的兴奋性谷氨酸，而降低兴奋性谷氨酸释放后可明显减轻视网膜神经节细胞的凋亡，提示谷氨酸可能对视网膜神经节细胞有毒性作用^［8-9］。
    hUCMSCs是一种具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞^［10］，并且具有来源广泛，取材方便，不受伦理限制等诸多优点^［11］。研究发现，hUCMSCs具有分化为少突胶质细胞、神经元样细胞等神经细胞的能力，使其具有作为种子细胞应用于修复受伤或病变的神经组织的能力 ^［12-13］，这些研究为hUCMSCs眼内移植治疗RIRI提供了理论基础。
    PEDF是目前最重要的血管生成抑制因子，具有营养作用和多种生物活性，如抗血管生成、抗增殖、促分化、抗炎和抗肿瘤等，PEDF是由418个氨基酸构成的糖蛋白，相对分子质量约为50 000，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员之一，首先由Tombran-Tink等^［14］在RPE细胞培养基中发现，PEDF在人体的绝大多数组织中都有所表达，如肝组织、睾丸、卵巢、胎盘和胰腺等部位，眼内的PEDF主要由视网膜色素上皮细胞分泌，广泛存在于房水、玻璃体、睫状体、角膜组织中 ^［15-17］。Dawson等^［18］率先发现角膜、玻璃体无血管组织和PEDF的作用息息相关，对维持眼部透明的屈光系统有重要作用，VEGF是促血管生成因子，临床上许多增殖性疾病都与PEDF和VEGF比例失衡有关^［19-21］。研究发现，玻璃体内注射PEDF后，可降低ICAM-1、TNF-α、VEGF等炎症因子的释放^［22］，说明PEDF具有一定的抗炎作用。Yoshida等^［23］对大鼠糖尿病模型的研究发现，静脉注射PEDF后，视网膜8-OHdG、p22phox和VEGF水平以及NADPH氧化酶活性减弱。由上述可知，RIRI发病机制可能和炎症作用、氧化应激有关。Takita等^［24］在对RIRI的研究中发现，玻璃体内注射PEDF有助于防止视网膜神经节细胞层的变性和凋亡。这些研究结果为PEDF预防和治疗RIRI提供了理论基础。本研究结果显示PEDF基因转染的hUCMSCs能减少早期RIRI引起的视网膜神经节细胞的萎缩凋亡，对视网膜有一定的保护作用。本研究设计尚未涉及PEDF-MSCs在不同剂量下对视网膜神经的不同程度的保护作用，另外，免疫排斥反应的检测等都需要在以后的研究中进一步的探索与讨论，在实现临床转化与应用前仍然需要进一步探索。