《眼科新进展》  2018年4期 301-305   出版日期：2018-04-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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rno-miR-30b-5p调控Atg5、Atg12和Becn1自噬基因表达在实验性自身免疫性葡萄膜炎中的作用


    葡萄膜炎是一类临床常见的致盲性自身免疫性眼病，严重危害人类视觉健康。细胞自噬是通过细胞质中的酸性溶酶体对异常细胞器、蛋白质以及病原体的吞噬、降解，从而形成一种细胞内环境分解代谢的平衡机制，在机体的保护与防御方面发挥作用，特别是在免疫系统中发挥重要的生物学作用。研究证实，自噬失调会诱发多种疾病的发生，如感染、自身免疫性疾病等^［1］。因此，通过自噬调控机体的免疫平衡对稳定生物体的正常生理功能具有十分重要的意义。
    MicroRNA（miRNA）是一类在基因转录后水平调控靶基因的功能性小RNA分子，可以通过RNA干扰途径调控某些自噬相关基因（autophagy-related gene，Atg）及其调节因子的表达，miRNA表达异常可影响机体的自噬水平。研究表明，一些特定miRNA可以通过调控自噬分子的表达影响机体的免疫功能^［2-3］。有研究发现，miR-30b的表达水平与细胞自噬密切相关^［4-5］。我们前期研究表明，葡萄膜炎大鼠脾脏和淋巴结中rno-miR-30b-5p表达异常^［6］；生物信息学分析发现，Atg5、Atg12和Becn1可能是rno-miR-30b-5p调控的靶基因^［7］。但是，rno-miR-30b-5p对Atg5、Atg12和Becn1的表达调控作用尚不清楚。本研究拟通过双荧光素酶检测法观察荧光强度值的表达变化，明确rno-miR-30b-5p对Atg5、Atg12和Becn1的调控作用；实时荧光定量PCR（Q-PCR）检测大鼠脾脏和淋巴结中Atg5、Atg12和Becn1 mRNA的表达水平变化，ELISA方法检测自噬相关蛋白的表达情况，以初步阐释rno-miR-30b-5p调控Atg5、Atg12和Becn1自噬基因表达在葡萄膜炎发病机制中的作用，为临床寻找新的治疗靶点提供思路。
1　材料与方法
1.1　实验动物　健康Lewis大鼠12只（6~8周，体质量160~180 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司）随机分为正常对照组和实验性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis，EAU）组，每组各6只。EAU组在大鼠后肢足垫、两侧腹壁及躯干上皮下各点共注射200 μL含有光感受器间维生素A结合蛋白（interphotoreceptor retinoid-binding protein，IRBP）、结核分枝杆菌H37RA（tuberculin，TB）、完全弗氏佐剂（complete Freund’s adjuvant，CFA）和无菌PBS的乳糜液以诱导EAU；正常对照组大鼠在相同的部位注射等体积只含TB和CFA的乳糜液。免疫后12 d处死大鼠，取双眼眼球用于病理学观察，取脾脏和淋巴结，用Q-PCR及ELISA方法检测Atg5、Atg12和Becn1 mRNA和蛋白的表达情况。
1.2　主要试剂及仪器　293细胞、Lipofectamine^TM 2000转染试剂（美国Invitrogen公司）；高纯度质粒抽提试剂盒（德国QIAGEN公司）；荧光显微镜（日本Olympus公司）；生物安全柜（美国Thermo公司）；CO₂培养箱（香港力康公司）；报告基因检测试剂盒（Genomeditech）；DMEM培养基、2.5 g·L^-1胰蛋白酶（美国Gibco公司）；IRBP（1177-1191；氨基酸序列：ADGSSWEGVGVVPDV；上海生工生物工程股份有限公司合成）；TB（美国Difco公司）；CFA（美国Sigma公司）；miRNA组织/细胞快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）；cDNA逆转录试剂盒、2×SYBR Green I试剂盒和LightCycler^? 480实时荧光定量PCR仪（均购自美国Roche公司）；大鼠Atg5、Atg12和Becn1蛋白 ELISA试剂盒（武汉基因美生物科技有限公司）；miRNA转染试剂盒（广州锐博生物科技有限公司）；Dual-Glo^?Luciferase Assay System（美国Promega公司）；多功能酶标仪（美国Perkin-Elmer公司）；荧光分光光度计（F3000，日本日立公司）。
1.3　Genesis-D眼底相机观察大鼠眼底炎症表现及组织病理检测　在大鼠免疫后，每天用Genesis-D眼底相机观察每只大鼠眼底炎症表现并记录。取正常对照组及免疫后12 d EAU组大鼠眼球，用眼球固定液固定24 h后石蜡包埋、切片、HE染色，观察大鼠睫状体、视网膜病理学表现。
1.4　双荧光素酶检测rno-miR-30b-5p调控自噬的靶基因　接种构建成功的过表达载体菌液至5 mL LB培养液中，37 ℃摇床（220 r·min^-1）过夜培养；用高纯度质粒抽提试剂盒制备质粒。另将状态良好、处于对数生长期的空白293细胞用2.5 g·L^-1胰蛋白酶消化，用完全培养基悬浮成单细胞悬液，细胞计数后，接种于24孔培养板中；过夜培养，观察细胞生长状态。在细胞覆盖率为70％左右时进行转染实验。取2支EP管，先加50 μL的无血清DMEM培养基，一支EP管加质粒混匀，另外一支EP管加0.633 μL Lipofectamine^TM 2000转染试剂混匀，约5 min后将两管液体合并成一管，混匀后，室温放置15~20 min，均匀滴加至培养板中，于CO₂培养箱中培养。转染48 h后收集细胞，PBS洗涤2次，然后用100 μL细胞裂解液裂解各孔细胞。细胞裂解后，将样品转移至EP管中，荧光分光光度计测定各样品相对光单位（relative light unit，RLU）数值，并同时检测空白对照孔（实验具体设置见表1）。将检测出的各组RLU值进行数据分析。




1.5　Q-PCR检测　每组大鼠随机各取4只处死，在无菌条件下分离脾脏和淋巴结，将组织研磨后，用尼龙毛柱收集细胞，按照miRNA组织/细胞快速提取试剂盒说明书提取miRNA和总RNA，用K5600分光光分度计检测RNA的纯度和浓度（A₂₆₀/A₂₈₀为1.8~2.1）。将提取的miRNA和总RNA用cDNA反转录试剂盒合成cDNA，进行Q-PCR检测（20 μL反应体系，每个基因设3个复孔）。U6为rno-miR-30b-5p的内参，β-actin作为Atg5、Atg12和Becn1基因的内参。引物序列分别为：U6 反转录引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’，双向引物序列包括上游引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；rno-miR-30b-5p反转录引物：5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGAT-ACGACAGCTGA-3’，双向引物序列包括基因特异性引物（gene specific primer，GSP引物）：5’-GGGCTGTAAACATCCTACAC-3’，反向引物（reversed primer，RP引物）：5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’；β-actin上游引物：5’-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3’，下游引物：5’-CCCATACCCACCATCACACC-3’；Atg5上游引物：5’-TCAACGAAATGCAGAGAAAAGACC-3’，下游引物：5’-CGGCCACAGGACGGAACA-3’；Atg12上游引物：5’-CTGCTGCGGCGGGCGAGAG-3’，下游引物：5’-GGGCGAAACTGCAACCGAAGACG-3’；Becn1上游引物：5’-AGCGGACAATTTGGCACGAT-3’，下游引物：5’-GTACAACGGCAACTCCTTAGATTT-3’。Q-PCR反应条件为：95 ℃、5 min，循环1次；95 ℃、20 s，57 ℃、25 s，60 ℃、25 s，循环45次。Q-PCR检测反应结束后，按照2^-ΔΔCt计算rno-miR-30b-5p、Atg5、Atg12和Becn1基因表达水平，并对各组数据进行统计学分析。
1.6　ELISA检测　每组大鼠随机各取2只处死，在无菌条件下分离脾脏和淋巴结，分别用液氮研磨至细粉状，加入350 μL RIPA裂解液溶解。电动匀浆30 s后，用超声波细胞粉碎机冰上超声20 min，然后8000 r·min^-1、4 ℃离心20 min。去沉淀取上清后，转移至新的EP管中，微量紫外分光光度计测定各组蛋白浓度，ELISA试剂盒检测Atg5、Atg12和Becn1蛋白的表达水平。
1.7　统计学分析　所有实验均重复3次，所得数据采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，计量资料均以x?±s表示，经Levene检验方差齐，组间的两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　大鼠眼底炎症表现及病理学检测　Genesis-D眼底相机观察发现，与正常对照组相比，免疫后7 d EAU组大鼠眼底血管开始肿胀，免疫后12 d达到高峰，眼底血管严重肿胀。病理学检测可见睫状体和视网膜内大量炎性细胞浸润（图1-图2）。




2.2　rno-miR-30b-5p调控自噬的靶基因　双荧光素酶检测结果表明，与空白对照相比，rno-miR-30b-5p对Atg5、Atg12和Becn1野生型的RLU值有较明显的下调表达，对其预测靶位点进行突变后，突变型载体中的RLU值改变不显著（图3）。由此可以得出，rno-miR-30b-5p可明显调控带有Atg5、Atg12和Becn1基因片段3’UTR基因的表达，Atg5、Atg12和Becn1为rno-miR-30b-5p调控的靶基因。
2.3　EAU大鼠脾脏和淋巴结中rno-miR-30b-5p的表达　Q-PCR检测结果发现，正常对照组设为1.00，EAU组大鼠脾脏和淋巴结中rno-miR-30b-5p mRNA水平分别为0.46±0.01和0.29±0.17，均呈下调表达（均为P<0.01）。由此可见，rno-miR-30b-5p在EAU发病进程中可能发挥重要作用。
2.4　Atg5、Atg12和Becn1基因和蛋白的表达水平　Q-PCR检测结果发现，与正常对照组相比，免疫后12 d的EAU组大鼠脾脏和淋巴结中Atg5、Atg12和Becn1 mRNA水平均呈现明显的上调表达，差异均具有统计学意义（均为P<0.05）；ELISA检测结果发现，与正常对照组相比，免疫后12 d的EAU组大鼠脾脏和淋巴结中Atg5、Atg12和Becn1蛋白水平均呈现明显的上调表达，差异均具有统计学意义（均为 P<0.05）。提示 rno-miR-30b-5p可负调控Atg5、Atg12和Becn1基因的表达水平，从而在葡萄膜炎的病理发展进程中发挥调控作用。




3　讨论
    葡萄膜炎通常是一类由T细胞介导的自身免疫性疾病，临床常反复发作，对患者身心均造成较大影响。miRNA在多种自身免疫性疾病中表达异常，提示miRNA与自身免疫性疾病的发生、发展密切相关。Mandolesi等^［8］研究证实，miR-142-3p的表达上调在IL-1β介导的突触功能障碍中起主要作用，可导致自身免疫性脑脊髓炎和多发性硬化症患者的兴奋毒性损伤；miR-301a-3p和Th17细胞在类风湿性关节炎患者外周血中表达均明显升高，提示miR-301a-3p在疾病发展进程中可能发挥重要作用^［9］；Turini 等^［10］在孢子菌感染的小鼠肺组织内发现let-7e-5p表达显著升高，认为let-7e-5p 水平的异常升高可能与小鼠的免疫应答有关；miR-27 在小鼠T细胞中的过表达可以抑制调节性T细胞的分化，导致调节性T细胞功能的紊乱，进而造成小鼠免疫耐受功能障碍^［11］。Singh等^［12］研究发现miR-30b-5p在先天免疫和TLR信号通路中发挥了调节作用；Liu等^［13］ 证实miR-30b-5p与细胞增殖和迁移有关。自噬是维持细胞内稳态的关键，巨噬细胞中多个自噬基因的缺失可导致炎症介导的眼科疾病，如葡萄膜炎^［14］。Li等^［15］的研究结果显示，miR-30b在饥饿条件下可显著促进细胞自噬，而Atg5是miR-30b调控的靶基因；在肝缺血再灌注损伤模型中，miR-30b可通过减少Atg12-Atg5复合体的形成抑制自噬的发生，从而减轻肝缺血再灌注造成的损伤；Chen等^［16］研究也发现，抗miR-30b干预小鼠软骨细胞可通过增强Becn1和Atg 5自噬基因的表达抑制肿瘤坏死因子-α介导的细胞凋亡，从而减轻软骨退化。上述研究表明，miR-30b的异常表达与细胞自噬密切相关。
    本研究中我们发现，在双荧光素酶检测中，与空白对照相比，Atg5、Atg12和Becn1的RLU值有较明显的下调表达，说明rno-miR-30b-5p可调控Atg5、Atg12和Becn1基因的表达，即Atg5、Atg12和Becn1基因为rno-miR-30b-5p调控的靶基因。脾脏和淋巴结作为重要的外周淋巴器官，可在机体的免疫调节中发挥重要作用。本研究结果表明，免疫后12 d，EAU大鼠的眼底血管严重肿胀；Q-PCR和ELISA检测结果也证实，与正常对照组相比，免疫后12 d的 EAU大鼠脾脏和淋巴结中rno-miR-30b-5p的表达水平明显降低，而其调控的靶基因Atg5、Atg12和Becn1的表达明显升高，ELISA结果也证实了该结论，提示rno-miR-30b-5p可通过调控Atg5、Atg12和Becn1的表达，从而在葡萄膜炎的病理进程中发挥作用。本研究结果为临床治疗EAU提供了新的干预靶点和思路。