《眼科新进展》  2018年3期 226-229   出版日期：2018-03-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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载汉防己甲素壳聚糖纳米微球的制备及其对人翼状胬肉细胞增殖的抑制作用


    汉防己甲素（tetrandrine，Tet）是一种由中药防己、粉防己或千金藤中提取的化学物质，属于生物碱^［1］。已有学者将其应用于抑制翼状胬肉术后复发的研究^［2-5］。近年来，壳聚糖（chitosan）在药物的缓释、控释及生物医用材料等方面的研究受到广泛的关注^［3-5］。目前尚未见有关负载Tet的壳聚糖纳米载药体系的报道。本研究合成的载Tet壳聚糖纳米微球，载药量高，缓释时间长，并能有效抑制人翼状胬肉成纤维细胞增殖。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　主要试剂　Tet（西安山川生物技术有限公司），壳聚糖（上海伯奥生物有限公司），1-乙基3-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸（上海共价化学科技有限公司），脱氧胆酸（比利时Acros公司），细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8；日本Dojindo 公司）。
1.1.2　人翼状胬肉成纤维细胞的培养　胬肉组织标本为佛山市第一人民医院眼科手术切除组织，采用组织块培养法培养人翼状胬肉成纤维细胞。将翼状胬肉组织碎块浸没入培养基中（10 mL体积分数10%胎牛血清加入90 mL DMEM-F12培养基），置于含体积分数5%CO₂培养箱中培养，当成纤维细胞从组织块周围逐渐长出并相互接触后，进行传代。本实验取第3～6代成纤维细胞进行实验。
1.2　方法
1.2.1　脱氧胆酸接枝壳聚糖衍生物的化学合成　参考文献的合成方法^［6］，取2.0 g壳聚糖混悬于10 g·L^-1醋酸溶液中，搅拌溶解。量取6.0 mL无水乙醇，溶解1.3 g EDC·HCl ［1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐］和1.6 g的脱氧胆酸，滴入到壳聚糖溶液中，作用24 h。滴加乙醇/氨水溶液将溶液pH调节达弱碱性，所得液体离心（4500 r·min^-1，15 min），去除上方液体，取下方沉淀物质。乙醇洗涤沉淀物三次，然后离心（4500 r·min^-1，15 min），冷冻使沉淀物质干燥，得到新型壳聚糖衍生物（deoxycholic acid-modified chitosan，DAMC），名为脱氧胆酸基团接枝的DAMC。利用KBr（溴化钾）压片法测定红外光谱法（FTIR）图，分析DAMC的化学结构。
1.2.2　DAMC载药纳米微球的制备及其载药性能测试　在3.0 mL蒸馏水中加入10.0 mg DAMC，磁力搅拌使DAMC溶解；按表1中Tet/DAMC的配比称取Tet，溶于0.4 mL四氢呋喃中，逐滴加入DAMC液体中，再取1.0 mL水，缓慢滴入反应液体中，在磁力搅拌下作用24 h。将上述反应液置于45 ℃水浴中，持续搅拌至四氢呋喃从溶液中完全蒸发。最后将溶液离心（4500 r·min^-1，10 min），所得上清液即为载药壳聚糖纳米药物溶液。采用紫外分光光度法，在波长284 nm下测出溶液中Tet的质量，按下面公式计算载药量：载药量=［（药物总质量-未负载药物质量）/DAMC质量］×100%^［6］。
1.2.3　Zeta电位测定　按表1中Tet/DAMC的不同质量配比，分别为1∶5、2∶5、3∶5、4∶5、5∶5，制备不同载药量的DAMC载药纳米微球样品，Zeta电位分析仪依次测定各样品的Zeta电位。
1.2.4　透射电子显微镜分析　将制备的样品滴到铜网膜上，晾干，将20 g·L^-1磷钨酸溶液滴加到样品上使其染色，晾干后再放置于透射电子显微镜下，观察不同载药量下纳米微粒的粒径和粒形情况。
1.2.5　体外释放实验　采用动态透析法对载药纳米微球进行体外药物释放实验（重复测量3次）。将表1中3.5 mL的3号载药纳米微球溶液置于透析袋中，透析袋两端系紧，以200 mL的pH 6.2 PBS缓冲液和乙醇的混合液（PBS缓冲液/乙醇=80/20，v/v）作为释药介质^［7］，在（37.0±0.5）℃脱氧胆酸基团接枝的DAMC，100 r·min^-1条件中进行体外释放实验。在不同时间点取出释药介质2.0 mL，再加入等量的同种介质。取出的介质溶液置于分光光度计中，在284 nm波长下测定Tet含量，按下面公式计算纳米微球中Tet的累积释放百分率：药物释放率=（释放的药物质量/药物总质量）×100％^［6］。
1.2.6　人翼状胬肉成纤维细胞的细胞活性测定　参考文献^［3］选取Tet药物浓度为10×10^-6 mol·L^-1。取人翼状胬肉成纤维细胞以培养基制备30×10⁶ L^-1细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔加入100 μL细胞悬液。24 h后贴壁，弃去培养基，分别加入含100×10³ U·L^-1青霉素和100 mg·L^-1链霉素培养基稀释的DAMC，Tet，Tet/DAMC纳米粒溶液，Tet终浓度均为10×10^-6 mol·L^-1，设置对照组，每组5个复孔。培养第1天、3天、5天后，弃去培养液，加入新的培养基及10 μL CCK-8，继续培3 h。在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度（A）值（λ=450 nm）。按下面公式计算细胞生存率：细胞生存率=实验组A值/对照组A值×100%^［8］。
1.3　统计学分析　采用SPSS 17.0统计学软件分析数据，定量数据采用均数±标准差表示，计量资料采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
2　结果
2.1　DAMC的化学结构分析　壳聚糖、脱氧胆酸及DACM的FTIR图谱显示，与壳聚糖的图谱相比，DAMC图谱中位于1659×10^-3 m^-1处和1566×10^-3 m^-1处出现酰胺基特征峰，DAMC图谱中位于1600×10^-3 m^-1处氨基特征峰则消失，说明脱氧胆酸上的-COOH通过酰胺化反应与壳聚糖上的-NH₂进行了链接。另外脱氧胆酸图谱中1708×10^-3 m^-1处的特征峰完全消失，说明脱氧胆酸上的-COOH已被取代。
2.2　DAMC的载药性能　表1为DAMC纳米微球的载药量、Zeta电位和粒径结果，Tet的投入量对载药量有明显的影响，投入量增加，载药量也随之增加，逐渐升高至76%，Zeta电位则呈相反的变化趋势，随着投入药物量的增加，Zeta电位出现下降的趋势。当载药量小于44%时，与空白纳米微球相比，载药纳米微球Zeta电位基本趋于稳定，变化不大，但随载药量的持续增加，Zeta电位开始出现明显降低。
    图1中的透射电镜图片显示，当DAMC纳米微球未负载药物时，其微观形态为较均匀的球形或类球形，粒径约50 nm（图1A），随着Tet负载量的增加，DAMC载药纳米微球的粒径逐渐增大至50~150 nm、100~200 nm及300~500 nm（图1B-1D，表1）。





2.3　DAMC载药纳米微球的体外释放药物研究　选取了表1中3号DAMC载药纳米微球进行体外释放实验，释放行为如图2所示，药物的释放比较缓慢，早期存在突释现象，前8 h累积释放出的药物量约为释放总量的23.2%，之后药物释放趋于平缓，48 h后药物的释放基本停止，释放的药物量为释放总量的45.6%，说明纳米药物具有缓慢将药物释放的作用。
2.4　纳米微球对人翼状胬肉成纤维细胞的细胞活性的影响　Tet/DAMC纳米微球分别作用于人翼状胬肉成纤维细胞第1天、3天、5天后细胞活性结果表明（图3），随着药物作用时间的延长，Tet和Tet/DAMC对细胞增殖的抑制作用均逐渐增强，Tet组第1天、3天、5天细胞活性分别为（60.70±2.30）%、（50.22±2.35）%、（21.99±2.07）%，而Tet/DAMC组第1天、3天、5天细胞活性分别为（79.77±2.09）%、（63.24±2.83）%、（40.28±1.19）%，与Tet组相比，其抑制作用明显减弱，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。



3　讨论
    翼状胬肉是眼科临床的常见病和多发病，手术切除翼状胬肉是临床最常见和有效的治疗方法，但术后复发是眼科临床有待解决的难题之一。有研究表明Tet体外可以明显抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和小管形成，具有明显抗血管形成的效应^［9］。另外Tet可以直接抑制胬肉组织中VEGF的分泌^［5］，以及通过抑制钙离子通道，抑制翼状胬肉成纤维细胞的增殖^［4］。眼局部给药常用的剂型是滴眼剂，但因药物在眼表保留的时间短（1～3 min），药物在眼表的利用率较低，只有通过频繁给药才能达到治疗的作用，一些药物经泪道黏膜吸收后可引起全身副作用^［9-10］。因此，研发新剂型眼用药物，克服常规滴眼剂的不利因素，对于眼科疾病的治疗具有重要意义。
    本研究中成功合成了脱氧胆酸接枝的新型壳聚糖衍生物，在水中通过简单的自组装即可形成纳米微球。本研究表明脱氧胆酸接枝的壳聚糖衍生物对Tet具有极佳的包载能力，随着投入药物量的增加，载药量呈现持续增加的现象，且最高时达到76%。而其他纳米载药系统负载Tet的载药量在35%以下^［11-12］。随着载药量的增加，DAMC载药纳米微球的粒径也持续增加（图1B-1D），但粒径保持在50~500 nm。研究表明^［13］，纳米粒粒径小于250 nm时，有利于纳米药物透过细胞屏障和细胞膜，提高药物利用率。表1中3号载药纳米微球粒径为100~200 nm，粒径适中，载药量也较高，因此选取3号样品进行体外释放实验以及接下来的细胞实验。
    本研究中Zeta电位的结果显示，DAMC纳米微球带正电荷，负载Tet药物后，纳米微球仍带正电荷，随载药量的增加有所下降，但Zeta电位仍始终保持正值，说明大部分药物可能负载于胶束内部，这与Pignatello等^［14］和Barbu等^［15］报道的一致。纳米胶束表面带正电荷，这有利于与带负电荷的细胞膜相互作用，增强细胞对载药纳米胶束的摄取^［16］。泪液的黏蛋白层中糖基侧链中含有大量COO-和SO₃-，使眼表表面附带负电荷^［17］，正负电荷的静电作用将有助于延长载药纳米微球眼表滞留时间，更好地发挥药物的治疗作用。
    程国华等^［11］合成的载Tet纳米药物体外缓释时间为3 h，本研究结果显示载Tet的壳聚糖纳米微球具有缓慢持续释放药物的作用，且释放的时间可持续达48 h。因此药物能够在眼表持续平稳释放，减少泪液循环带来的药物流失。而尚未释放出来的药物，可在体内通过溶菌酶的降解进一步释放出来^［18］。
    壳聚糖几乎无毒性，具有良好生物安全性。研究者^［18］发现壳聚糖浓度为2.0 g·L^-1时，仍未对结膜上皮细胞产生任何的毒性。细胞实验中，DAMC纳米微球对翼状胬肉成纤维细胞的细胞活性未产生影响。表明其对细胞没有毒性，生物安全性良好。研究表明Tet具有抑制成纤维细胞的作用^［19-20］。体外细胞实验显示Tet和Tet/DAMC均能抑制人翼状胬肉成纤维细胞的增殖，Tet组第1天、3天、5天细胞活性分别为（60.70±2.30）%、（50.22±2.35）%、（21.99±2.07）%，而Tet/DAMC组分别为（79.77±2.09）%、（63.24±2.83）%、（40.28±1.19）%，可见随着药物作用时间的延长，Tet和Tet/DAMC对细胞增殖的抑制作用均逐渐增强。而与Tet相比较，Tet/DAMC的抑制作用减弱，即对细胞的毒性作用降低。这是由于纳米药物 Tet/DAMC纳米微球具有缓释Tet药物的作用，因此作用于细胞的药物量减少，延长了Tet药物对人翼状胬肉成纤维细胞的抑制作用时间，同时也降低了药物对正常组织细胞的毒性作用。
    综上所述，本研究合成的载Tet纳米药物具有高载药量，粒径适中，且缓释时间长等优点。细胞实验也显示具有抑制翼状胬肉成纤维细胞的作用，具有一定的研究应用前景。