《眼科新进展》  2018年3期 218-221   出版日期：2018-03-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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丝胶对糖尿病大鼠视网膜氧化应激和微炎症状态的改善作用


    糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）可导致不可逆盲，严重影响患者的生活质量^［1］。DR发病机制复杂，目前的研究表明^［2-4］，氧化应激和微炎症参与了DR的发生发展，可加剧 DR的病理进程。丝胶为蚕茧中的高分子水溶性蛋白，是一种天然的细胞保护剂，具有抗氧化、抗炎等生物活性，但丝胶是否对DR病理过程中视网膜的氧化应激和炎症损伤具有保护作用鲜有研究报道。本研究拟采用糖尿病大鼠模型，通过观察视网膜中丙二醛（malondialdehyde，MDA）和还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）的含量、核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、血红素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO-1）、核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表达的变化，探讨丝胶对糖尿病大鼠视网膜氧化应激和微炎症状态的改善作用。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验动物　SPF级雄性SD大鼠36只，体质量170～190 g，鼠龄2～3个月，购自北京维通利华实验动物公司，饲养于承德医学院清洁级动物实验室，单笼饲养，温度（23±1）℃，相对湿度为50%±5%，12 h/12 h光暗循环，自由饮食。
1.1.2　主要试剂及仪器　采用正交试验法优选蚕茧中丝胶蛋白（承德医学院蚕业研究所制备）；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ，美国Sigma公司）；MDA、GSH检测试剂盒（南京建成生物科技有限公司）；高效RIP组织/细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；兔抗大鼠Nrf2多克隆抗体（武汉博士德生物工程公司），兔抗大鼠HO-1多克隆抗体、兔抗大鼠NF-κB多克隆抗体、兔抗大鼠TNF-α多克隆抗体（英国 Abcam公司）。
1.2　方法
1.2.1　动物模型制备及分组　采用高脂高糖喂养联合20 g·L^-1 STZ 25 mg·kg^-1·d^-1连续腹腔内注射3 d，制备糖尿病大鼠模型，STZ注射1周后大鼠空腹血糖≥16.7 mmol·L^-1为造模成功。将24只成模的大鼠随机分为丝胶治疗组和糖尿病模型组，每组12只，另外同周龄12只正常大鼠为正常对照组。成模后按照本研究组前期研究结果，给予丝胶治疗组的大鼠2.4 g·kg^-1·d^-1丝胶空腹灌胃，每天1次，连续给药35 d。正常对照组和糖尿病模型组大鼠给予等体积生理盐水灌胃，时间点同丝胶治疗组。
1.2.2　取材　35 d干预结束后，行腹腔内注射100 g·L^-1水合氯醛（0.5 g·kg^-1体质量）过量麻醉处死3组大鼠。每组取6只大鼠，迅速摘取眼球，分离视网膜组织并加入冰生理盐水制成50 g·L^-1的组织匀浆，离心后取上清用于氧化应激指标的含量测定。每组取另外6只大鼠，迅速摘取双侧眼球，将一侧眼球浸入体积分数4%中性甲醛溶液中固定后石蜡包埋；另一侧眼球分离视网膜，置于液氮中保存。
1.2.3　视网膜氧化应激指标MDA和GSH含量的检测　按照试剂盒说明书进行，分别采用硫代巴比妥酸法、二硫代二硝基苯甲酸法检测3组视网膜中MDA和GSH含量。
1.2.4　免疫印迹法检测视网膜组织中Nrf2、HO-1、NF-κB和TNF-α的蛋白表达　取液氮中保存3组视网膜匀浆，提取蛋白质，BCA法测蛋白浓度。120 g·L^-1 SDS-PAGE凝胶电泳，80～120 V 2 h，蛋白上样40 μg，转膜2 h，分别加入Nrf2、HO-1、NF-κB 和TNF-α一抗（均为1∶200），室温下摇床孵育2 h，洗膜后加入HRP标记二抗（1∶1000）孵育2 h，超敏发光试剂显影。Image J软件分析，以Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α条带与β-actin条带的灰度值比值作为其蛋白的相对表达水平。
1.2.5　HE染色观察视网膜形态结构　将眼球平行于视神经的矢状轴连续切片，片厚4 μm，二甲苯脱蜡，下行梯度乙醇（体积分数依次为100%、95%、90%、80%、70%，各浸泡3 min）水化，苏木素染色10 min，体积分数1%盐酸酒精分色，伊红染色5 min，上行梯度乙醇（体积分数依次为70%、80%、90%、95%、100%，各浸泡3 min）脱水，二甲苯透明，封片，光镜下观察并拍照。
1.3　统计学方法　采用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析。数据以x?±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　各组大鼠视网膜组织中MDA和GSH含量比较　各组大鼠视网膜组织中MDA和GSH含量比较见表1，由表1可见：各指标三组整体比较差异均有统计学意义（均为P<0.01）。糖尿病模型组大鼠视网膜组织中MDA含量明显高于正常对照组（t=12.762，P<0.05），丝胶治疗组视网膜组织中MDA含量显著低于糖尿病模型组（t=8.754，P<0.05）；糖尿病模型组的视网膜组织中GSH含量明显低于正常对照组（t=6.721，P<0.05），丝胶治疗组视网膜GSH含量显著高于糖尿病模型组（t=4.398，P<0.05）。
2.2　各组大鼠视网膜组织中Nrf2、HO-1、NF-κB 和TNF-α的蛋白表达　各组大鼠视网膜组织中Nrf2、HO-1、NF-κB 和TNF-α的蛋白表达比较见表2，由表2可见：各指标三组整体比较差异均有统计学意义（均为P<0.01）。与正常对照组相比，糖尿病模型组大鼠视网膜组织中Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α蛋白表达均明显增高，差异均有统计学意义（t=6.356、7.073、10.568、13.214，均为P<0.05）；与糖尿病模型组大鼠比较，丝胶治疗组大鼠视网膜组织中Nrf2、HO-1蛋白表达明显增高（t=5.893、5.990，均为P<0.05），NF-κB、TNF-α蛋白表达明显降低，差异均有统计学意义（t=4.852、3.908，均为P<0.05；图1）。
2.3　视网膜HE染色结果　正常对照组大鼠视网膜分层清晰，细胞形态规则、排列整齐；糖尿病模型组大鼠视网膜分层欠清晰、细胞排列紊乱，视网膜内界膜肿胀、粗糙不平，神经节细胞呈空泡样改变，细胞水肿；丝胶治疗组视网膜分层较清晰，各层细胞形态较规则、排列轻度紊乱（图2）。






3　讨论
    近年的研究表明，氧化应激参与了DR的发生与发展^［5-6］。糖尿病时机体处于高血糖环境，视网膜缺血、缺氧可使非酶抗氧化物水平下降导致活性氧自由基增加，发生氧化应激反应，进而细胞膜的完整性遭到破坏，导致视网膜神经节细胞凋亡、光感受器损伤，微血管内皮细胞、周细胞凋亡及血-视网膜屏障破坏^［2，7］，从而促进DR发生发展。MDA是细胞内脂质过氧化作用的产物，其含量高低可代表脂质氧化损伤的程度，是间接反映组织细胞氧化应激水平的重要指标；GSH属于内源性抗氧化剂，是衡量人体抗氧化能力的重要标志^［8-9］。Nrf2/抗氧化反应元件（antioxidant responsive element，ARE）信号通路是内源性抗氧化应激的关键通路，在生理状态下，Nrf2定位于细胞质中，氧化应激状态下受到活性氧自由基的攻击后Nrf2与其抑制蛋白果蝇肌动蛋白结合蛋白 Kelch（Kelch-like ECH2 associated protein 1，keap1）解离，转位进入细胞核，与DNA上抗氧化反应元件ARE结合，诱导下游抗氧化蛋白HO-1表达上调，提高细胞抗氧化应激能力^［10-12］。氧化应激可促进DR慢性炎症的发生，这种低度慢性炎症又称为“微炎症”，被认为是糖尿病视网膜微血管损伤的重要因素^［13-14］。NF-κB是一种重要的核转录因子，能调控多种炎症因子的表达^［15-16］。高血糖状态下，视网膜细胞中的NF-κB通过上游的氧化应激被激活表达，此时NF-κB 成为DR微炎症过程中重要的中介因子，它可高效诱导其下游重要的炎性因子TNF-α的过度表达^［17-18］。TNF-α作用于视网膜微血管，诱导细胞间黏附分子表达增加，促使白细胞募集、滞留并黏附于血管内皮细胞，导致血管闭塞，血流灌注量降低，毛细血管的通透性增加，破坏血-视网膜屏障，促进DR进展^［19］。
    本研究成功建立糖尿病大鼠模型，发现糖尿病模型组大鼠视网膜的形态结构发生了明显的病理变化，细胞排列紊乱，视网膜内界膜肿胀、不平，神经节细胞呈空泡样改变，细胞水肿，并发现与正常对照组相比，糖尿病模型组大鼠视网膜组织中MDA的含量升高、GSH含量降低，NF-κB和TNF-α表达水平明显升高。这表明糖尿病高血糖状态时，机体的氧化和抗氧化能力失衡，视网膜发生了氧化应激损伤，进而激活炎症中介因子NF-κB，诱导炎性因子TNF-α过度表达，导致血-视网膜屏障的破坏，促进了视网膜的炎性损伤。本研究还发现，糖尿病模型组大鼠视网膜中Nrf2、HO-1表达较正常对照组升高，表明糖尿病状态下抗氧化Nrf2/ARE信号通路活化，细胞抗氧化应激能力增强。
    丝胶是天然的高分子水溶性蛋白，被覆于丝素上，将蚕丝蛋白纤维胶合在一起，构成蚕茧外围成分，主要由丝氨酸、甘氨酸和天冬氨酸等18种氨基酸组成，具有抗氧化、抗衰老等功效^［20］。本研究发现，与糖尿病模型组相比，丝胶治疗组大鼠视网膜组织中MDA的含量明显降低，GSH含量明显升高，NF-κB、TNF-α蛋白表达水平均明显降低，而Nrf2、HO-1蛋白表达水平明显升高，视网膜的形态结构出现明显改善。这表明丝胶可使Nrf2/ARE抗氧化通路持续活化并上调HO-1表达，拮抗糖尿病时视网膜的氧化应激损伤，进一步抑制NF-κB、TNF-α表达，减轻视网膜炎性介质的损伤，从而延缓DR发展。
    综上所述，丝胶可改善糖尿病时视网膜的氧化应激和炎症介质的损伤，这为DR的治疗提供了新方向。但因DR发病机制复杂，故丝胶对DR抗氧化、抗炎作用的深层机制尚需进一步探索。