《眼科新进展》  2018年2期 116-120   出版日期：2018-02-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
缓激肽对体外培养兔角膜内皮细胞增殖状况及对闭锁小带蛋白-1与相关性核酸结合蛋白表达的影响


    人角膜内皮细胞（corneal endothelial cells，CECs）再生能力十分有限，成年后CECs有丝分裂停滞于G1期，眼科疾病、炎症、外伤、手术及年龄增长均可导致CECs密度降低，重者可引起角膜内皮盲，最终导致失明［1-2］。因而探讨CECs的增殖能力与增殖机制具有深远的意义，眼科临床也亟需寻找并发现一些促进CECs增殖的新药物与新方法。缓激肽（bradykinin，BK）是一种局部肽类激素，参与炎症、疼痛、血管生成、细胞增殖、肿瘤发生、血-脑屏障通透性调节等诸多病理生理过程［3-7］。在角膜组织，研究证实BK可促进角膜上皮细胞、成纤维母细胞、角膜基质细胞及CECs等多种角膜相关细胞的增殖，然而具体机制不明［4-7］。闭锁小带蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1） 与闭锁小带蛋白-1相关性核酸结合蛋白（zonula occludens-1-associated nucleic-acid binding protein，ZONAB） 均属于紧密连接相关蛋白，两者相互作用并由此介导ZO-1/ZONAB信号通路，被证实与多种细胞的增殖分化有关，在CECs及视网膜色素上皮细胞亦有所报道［8-9］。为探讨BK促进CECs增殖的作用是否与ZO-1/ZONAB信号通路有关，本研究在前期建立的体外培养兔角膜内皮细胞（rabbit corneal endothelial cells，RCECs）模型的基础上，观察BK对RCECs增殖状况及对ZO-1和ZONAB蛋白表达的影响，初步探讨BK促进RCECs增殖的作用机制，以期为角膜再生提供新思路和新方法。
1　材料与方法
1.1　实验动物和主要试剂　50 d龄大耳白兔，体质量1~2 kg，雌雄不限，无眼部疾患及遗传性眼病，由南华大学实验动物部提供。所有动物喂养和实验过程均符合视觉与眼科研究协会（Association for Research in Vision and Ophthalmology，ARVO）有关实验动物的相关规定。BK（美国Abcam公司）；DMEM高糖培养基、胎牛血清和胶原酶I（美国Gibco公司）；青霉素链霉素双抗溶液和2.5 g·L-1胰蛋白酶消化液（Trypsin，美国HyClone公司）；MTT细胞增殖检测试剂盒（长沙维世尔生物科技有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒、全蛋白提取试剂盒以及核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒（南京凯基生物科技公司）；鼠抗ZONAB抗体（美国Invitrogen公司）；鼠抗ZO-1单克隆抗体（美国Abcam公司）；anti-β-actin（美国Proteintech公司）；全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）；倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公司）。
1.2　方法
1.2.1　RCECs原代培养与传代培养　采用揭膜法结合胶原酶消化法获取RCECs原代细胞。耳缘静脉快速注射10 mL空气处死家兔。无菌条件下摘取完整眼球，沿角膜巩膜内侧缘1 mm处环形剪下全层角膜，小心去除晶状体和虹膜后，用无菌温PBS液冲洗。将角膜凹面朝上置于无菌培养皿中，在解剖显微镜下小心将后弹力层及内皮细胞层剥离，PBS液反复清洗后，置于细胞培养瓶中，加入DMEM培养液（含1.0 g·L-1胶原酶I），于37 ℃细胞培养箱中消化16 h后，倒置显微镜下观察到内皮细胞变圆、间隙变清晰时，再加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，1000 r·min-1离心 5 min，弃上清液，加入PBS，再离心清洗2遍。加入 3 mL 培养液制成角膜内皮细胞悬液，按10×103个·cm-2 的密度接种于细胞培养皿，于体积分数5% CO2饱和湿度，37 ℃下培养。每2~3 d换液一次，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，拍照记录。当细胞融合时，加入2.5 g·L-1胰蛋白酶进行消化，37 ℃作用2 min。待细胞变圆、间隙变大且快要脱离培养皿底时，加入10 mL含胎牛血清的DMEM培养液中止消化，收集细胞悬液，1000 r·min-1 离心6 min，弃上清，加入10 mL培养液洗涤细胞1次，1000 r·min-1离心6 min，弃上清，最后加入3 mL培养液制成细胞悬液，按0.5×109个·L-1 接种于2个细胞培养瓶内，一分为二进行传代培养。
1.2.2　不同浓度BK处理细胞　传至2~3代时，消化后收集细胞悬液，按0.5×109个·L-1接种于24孔板。根据加药处理的不同，将RCECs随机分为5组：对照组（RCECs不做加药处理）、4种不同浓度BK组（分别采用终浓度为0.01、0.10、1.00、10.00 μmol·L-1 BK溶液处理细胞）。倒置相差显微镜下动态观察不同浓度BK组及对照组在不同时间点（0 h、24 h、48 h、72 h、96 h）细胞生长的生物学形态变化，并采集图像。
1.2.3　MTT检测　将RCECs按每孔10×103个细胞接种于96孔板，待细胞生长至 70%~80%融合时采用无血清培养基静置24 h，换含4种不同浓度的BK培养基培养，每个实验组设 5个复孔，同时设置 5 个复孔为空白对照。各组铺4块96孔板，分别在处理24 h、48 h、72 h、96 h每孔加入20 μL终浓度为5 g·L-1 MTT溶液，行MTT染色。采用Bio-Rad酶标仪分析并记录490 nm处的吸光度 （A）值。
1.2.4　Western blot检测ZO-1和ZONAB蛋白的表达　收集72 h时各组细胞，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化后放入离心管，做好标记，采用冰预冷PBS洗涤细胞一次，3000 r·min-1离心2 min，弃上清液，加入2 mL细胞培养液，轻轻吹打制成细胞悬液。ZO-1全蛋白的提取与ZONAB核蛋白的提取分别参照南京凯基全蛋白与核蛋白提取试剂盒的步骤进行操作，并按照考马斯亮蓝法（BCA蛋白定量试剂盒）进行蛋白定量检测。对蛋白质提取物进行SDS-PAGE凝胶电泳，电转移至硝酸纤维膜，体积分数5%脱脂牛奶封闭过夜。将膜分别放于含有1∶500的抗ZO-1抗体、1∶1000的抗ZONAB抗体及1∶1000的内参抗体β-actin一抗中，4 ℃孵育过夜。TBST洗4次，每次5 min。将膜置于 10 mL含 HRP标记的二抗（Proteintech）（1∶6000）中，室温下摇床振荡孵育1 h，TBST摇洗3次，每次15 min。用ECL试剂盒暗室内曝光，观察并记录结果。以β-actin为内参，采用Quantity One专业灰度分析软件将图片上每个特异性条带灰度值数字化并计算相对灰度值。以目的蛋白A值/内参照A值的比值表示所测目标蛋白的相对表达量。
1.3　统计学处理　应用统计学软件SPSS 17.0进行数据处理。数据以均数±标准差表示，各组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　BK对RCECs细胞形态的影响　加药72 h，各组细胞已完全贴壁，融合成片，倒置显微镜下可见细胞呈多边形，细胞间紧密连接形成良好的单层。加药96 h，各组细胞形态发生改变，大小不一，形态不规则，呈梭形、长条形改变，细胞间隙变大，随时间延长生长明显受限，凋亡明显增多。不同浓度BK组与对照组相比，细胞形态无明显差别，细胞贴壁融合成片，紧密连接成单层，生长活跃；当BK浓度升高至10 μmol·L-1时，细胞生长开始受限，细胞间隙变大，脱落细胞增多，细胞透光性变差（图1-图2）。



2.2　BK对RCECs细胞A值及增殖活力的影响　MTT检测结果显示，与对照组比较，0.01 μmol·L-1 BK处理24 h细胞的A值差异无统计学意义（P=0.382）；余各BK组与对照组相比，同一时间点（24 h、48 h、72 h、96 h）A值差异均有统计学意义（均为P<0.001）；其中，24 h与48 h各BK组的A值随BK浓度增加呈不断上升趋势，72 h与96 h A值在1.00 μmol·L-1 BK组达最高值，10.00 μmol·L-1处BK组A值反而降低。当BK浓度超过0.10 μmol·L-1 时，细胞的A值在72 h达最高值，至96 h A值反而呈下降趋势。以上表明，BK体外刺激后细胞A值升高，且增殖活力增强，具有浓度和时间依赖性（表1）。
2.3　BK上调RCECs紧密连接处ZO-1蛋白的表达　细胞培养72 h时各组RCECs细胞紧密连接处均存在ZO-1蛋白的表达。与对照组相比，除0.01 μmol·L-1 BK组外，其他各组ZO-1蛋白表达量明显上调，差异均具有统计学意义（均为P<0.05）；0.10~10.00 μmol·L-1 BK处理后，ZO-1蛋白表达量随BK浓度升高而增加，呈现出一定的浓度依赖性（图3）。



2.4　BK上调RCECs核内ZONAB蛋白的表达　细胞培养72 h各组RCECs细胞均存在ZONAB蛋白的表达。与对照组相比，各BK组ZONAB蛋白的表达均明显上调，差异均具有统计学意义（均为P<0.05）；0.10~1.00 μmol·L-1BK处理后，ZONAB蛋白的表达随BK浓度升高而增强，以1.00 μmol·L-1 BK作用最为显著，亦呈现出一定的浓度依赖性；而10.00 μmol·L-1 BK处理后，BK促进ZONAB蛋白表达的作用反而减弱（图4）。




3　讨论
    BK是激肽释放酶-激肽系统的一员，由相对分子质量较高的激肽原在血浆激肽释放酶作用下形成，主要分布于局部组织（血液中含量较少），并以旁分泌和自分泌的方式发挥作用［10］。BK依赖于B1和 B2两种受体，在高血压、慢性疼痛、炎症与血-脑屏障通透性调控等病理生理过程中起重要作用［3］。在兔与人的角膜组织，有学者证实了B1受体与B2受体的存在［11-12］。眼内的BK主要由泪液中所含激肽释放酶作用于激肽原而产生，各种外界刺激（如过敏原、风媒传播病原体、紫外线等）也可诱发结膜组织中肥大细胞释放组胺、血小板活化因子与BK等，介导眼球局部的过敏反应与角膜的慢性炎症［13］。
    体外研究证实，BK还能促进多种角膜细胞的增殖。前期研究发现，BK（0.10 nmol·L-1~10.00 mmol·L-1）浓度依赖性地促进角膜上皮细胞增殖及DNA合成、钙离子内流、基质金属蛋白酶-1和前列腺素E2的释放［4］；0.01~10.00 μmol·L-1范围的BK还能促进犬角膜成纤维细胞及基质细胞的增殖，其效应亦与浓度呈正相关，并可能与表皮生长因子受体有关［5-6］；另有学者发现，0.01 μmol·L-1 BK还可刺激牛CECs的增殖，促进细胞有丝分裂过程［7］。本研究利用0.01~10.00 μmol·L-1 BK对RCECs进行体外刺激，发现BK可促进细胞的增殖，并具有一定的浓度与时间依赖性：中低浓度（0.01~1.00 μmol·L-1）BK处理后细胞贴壁融合，紧密连成单层，增殖活力增强，而随着BK浓度升高（10.00 μmol·L-1）及培养时间的延长（96 h以上），细胞间隙变大，脱落细胞增多，增殖活力反而受限。
    然而，BK促进角膜细胞增殖的具体作用机制仍然不明。近年来研究发现，位于细胞间紧密连接的ZO-1/ZONAB信号通路可能是介导细胞增殖的重要途径。ZO-1是紧密连接的主要跨膜蛋白，而ZONAB作为一种Y-box转录抑制因子，主要穿梭于细胞间紧密连接与细胞核之间，ZONAB通过与ZO-1中Src同源区3结构域结合，使ZONAB局限于细胞质，抑制ZONAB及下游效应基因的核内转录进而抑制细胞的增殖，而当ZONAB处于游离状态时，位于核内的ZONAB则促进相关基因表达和细胞增殖［14］。ZO-1与ZONAB相互作用，并受到众多因子的调控，构成ZO-1/ZONAB信号通路［15-16］，参与肾小管、视网膜、角膜等多种组织细胞的增殖与分化过程［8-9，17-18］。通过转基因小鼠过表达ZONAB可增加MDCK细胞的生长密度，而ZONAB被抑制则降低细胞生长密度［17］；ZONAB过表达与 ZO-1 低表达还能增加视网膜色素上皮细胞5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞的数量和比例，表明其细胞增殖促进作用［8］；在人CECs，慢病毒转染ZO-1诱导ZO-1的低表达，60岁人群CECs密度1周后增加50%，提示ZO-1低表达可促进体外人CECs的增殖［9］；在Ⅱ型肺泡上皮细胞，ZONAB高表达显著促进细胞的增殖并抑制其转分化，而ZONAB低表达时细胞增殖减少，转分化增多［18］。本研究通过RCECs体外模型发现BK不但促进核内ZONAB蛋白的表达，同时上调紧密连接处ZO-1蛋白的表达。BK作用后，ZONAB与ZO-1蛋白的表达均增强，激活下游促增殖基因的转录进而促进细胞的增殖。
    综上所述，BK体外刺激可促进RCECs细胞的增殖，同时上调紧密连接处ZO-1与核内ZONAB蛋白的表达，表明ZO-1/ZONAB信号通路可能在BK介导的RCECs增殖过程中起重要作用，为角膜再生提供了新的研究思路和药物治疗靶点。