《眼科新进展》  2017年12期 1114-1118   出版日期：2017-12-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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维生素B12对糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡的影响


    糖尿病视网膜病变作为2型糖尿病的主要并发症之一，是导致糖尿病患者视力损伤的重要原因，也是防盲治盲的主要难题^［1］。目前临床上治疗糖尿病视网膜病变主要聚焦于防止视网膜新生血管形成以及血管渗漏^［2］，而忽略了视网膜神经元病变对糖尿病患者视力的早期影响。有研究表明，糖尿病视网膜神经元进行性病变的发生远早于视网膜新生血管形成，是糖尿病患者早期视力损伤的重要影响因素^［3］，其发病机制可能是由于糖尿病患者体内产生过量的活性氧簇以及抗氧化剂的减少，导致体内过氧化反应增强，从而损伤视网膜神经元^［4］。维生素B12作为体内重要的元素之一，参与体内各种代谢活动，是机体重要的抗氧化剂^［5-6］。大量研究表明维生素B12对周围神经有很好的保护作用，可以加快受损伤轴突的生长速度，促进周围神经损伤后的功能重建^［7］；乔芳^［8］发现对于糖尿病周围神经病变患者联合应用甲钴胺与胰激肽原酶有很好效果。本实验通过建立糖尿病大鼠模型，给予大鼠维生素B12灌胃治疗，观察维生素B12对糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡的影响，并探讨其作用机制。
1　材料与方法
1.1　实验动物与分组　选取雄性2月龄清洁级SD大鼠 36 只，体质量（250±20）g，随机分为正常对照组（NC组）、糖尿病模型组（DM组）、维生素B12治疗组（VitB12组），每组12只，购自锦州医科大学实验动物研究中心，饲养于锦州医科大学附属第一医院动物房，饲养环境符合医学实验动物环境设施要求。
1.2　主要试剂和仪器　链脲佐菌素、丙二醛测定试剂盒、超氧化物歧化酶测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），维生素B12粉剂（合肥博美生物科技有限责任公司），TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒、免疫组织化学SP试剂盒、兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗体（沈阳万类生物科技有限公司）。
1.3　方法
1.3.1　糖尿病模型的制作　DM组、VitB12组大鼠禁食12 h后，一次性腹腔注射链脲佐菌素溶液（60 mg·kg^-1）制作糖尿病模型。72 h后测空腹血糖值≥16.7 mmol·L^-1为造模成功。NC组注射等体积的柠檬酸钠缓冲液，72 h 后测空腹血糖值（4.0~7.0 mmol·L^-1）。
1.3.2　给药方式及观察　造模成功后，VitB12组每天给予维生素B12水溶液100 μg·kg^-1，用灌胃针进行灌胃1次，持续治疗8周；NC组和DM组每天进行1次等体积生理盐水灌胃，持续8周。每周1次测量血糖、体质量，观察饮水量及尿量变化。实验过程中，VitB12组和DM组大鼠血糖均无自行恢复，每天饮水量、尿量明显高于NC组，体质量明显低于NC组。
1.3.3　取材及标本制备　停止灌胃2周后，所有大鼠均于第10周末用100 g·L^-1水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速取颈静脉血，离心后取上层血清。立即摘取右眼眼球浸入40 g·L^-1多聚甲醛固定液中24 h后，去除眼前节，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，行与视神经矢状轴平行的视网膜连续切片。
1.3.4　血清氧化应激指标的检测　收集静脉血离心后取上层血清，硫代巴比妥酸法测定丙二醛，黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶，严格按照说明书操作，由分光光度计比色法测定。每个指标重复操作5次，取平均值。
1.3.5　视网膜神经细胞凋亡和Caspase-3 蛋白表达的检测　视网膜神经细胞凋亡的检测：采用TUNEL法，按照说明书进行检测。细胞核中有棕色颗粒者为阳性细胞，在 200 倍光学显微镜下以视网膜神经节细胞层为观察边框，每张玻片随机选5 个视野，计数阳性细胞数和视网膜神经细胞总数得到平均值，计算凋亡指数（apoptosis index，AI），即 AI = 凋亡细胞数/视网膜神经细胞总数×100%。视网膜Caspase-3蛋白表达的检测：采用免疫组织化学法，按照说明书进行检测。细胞核及细胞浆呈黄色或棕黄色染色者为阳性细胞。用计算机辅助图像分析系统分析，对染色阳性物质进行光密度测定，在200倍光学显微镜下每张切片随机选取5个视野，计算平均光密度值。
1.4　统计学分析　采用SPSS 20.0统计软件分析所有数据，计量资料以x?±s表示，多组计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　各组血清氧化应激指标的比较　三组大鼠血清丙二醛含量比较，差异有统计学意义（F=471.061，P=0.000），DM组、VitB12组丙二醛含量高于NC组（均为P＜0.01），DM组高于VitB12组（P＜0.01）；三组间血清超氧化物歧化酶活性差异有统计学意义（F=356.923，P=0.000），DM组、VitB12组超氧化物歧化酶活性低于NC组（均为P＜0.01），DM组低于VitB12组（P＜0.01，见表1）。
2.2　各组视网膜神经细胞凋亡情况
2.2.1　显微镜观察结果　三组大鼠视网膜神经节细胞层、内核层和外核层均可见凋亡细胞，DM组和VitB12组凋亡细胞数较NC组明显增多，VitB12组凋亡细胞数较DM组有不同程度减少（图1）。
2.2.2　各组视网膜神经节细胞AI　三组视网膜神经节细胞AI值比较差异有统计学意义（F=14.926，P=0.000），DM组、VitB12组AI值均高于NC组（均为P＜0.01），DM组AI值高于VitB12组（P＜0.05，见表1）。




2.3　各组视网膜神经细胞Caspase-3蛋白表达情况
2.3.1　显微镜观察结果　三组大鼠视网膜神经节细胞层、内核层和外核层均可见Caspase-3蛋白表达，DM组和VitB12组Caspase-3蛋白表达均较NC组明显增多，VitB12组Caspase-3蛋白表达较DM组明显减少（图2）。



2.3.2　各组视网膜Caspase-3光密度值情况　三组视网膜Caspase-3光密度值比较差异有统计学意义（F=77.896，P=0.000），DM组、VitB12组视网膜Caspase-3光密度值均高于NC组（均为P＜0.01），DM组高于VitB12组（P＜0.01，见表1）。
3　讨论
    糖尿病视网膜病变作为2型糖尿病的主要并发症之一，是导致糖尿病患者视力损伤的主要因素。糖尿病视网膜病变发病机制较为复杂，是多因素、多机制共同作用的结果。目前普遍认为其机制主要是糖尿病微循环代谢障碍引起视网膜缺血缺氧进而导致视网膜微血管病变，发病原因与氧化应激^［9］、炎症反应及基因多态性等多种因素有关^［10-11］。研究表明，在糖尿病引起视网膜微血管病变前已发生了视网膜神经元的病变，糖尿病代谢紊乱可能首先影响视网膜神经元，微血管病变则是其继发影响的结果^［3］。视神经元病变的发生与视网膜光感受器细胞及神经节细胞等神经细胞的凋亡密切相关^［12］。所以，研究早期糖尿病视网膜神经细胞的凋亡机制及延缓视网膜神经细胞凋亡的发生，对于糖尿病视网膜病变的早期预防和治疗有重要价值。
    氧化应激在细胞凋亡中有着重要作用，有研究发现在病理情况下通过线粒体电子传递链产生的过量活性氧簇在诱导细胞凋亡中起关键作用^［4］。Scatena^［13］报道活性氧簇在皮摩尔水平可诱发细胞凋亡。Perdomo等^［14］发现活性氧簇可以触发线粒体释放PKC，它是激活Caspase-3的重要事件，同时是启动凋亡的关键步骤。Caspases家族是哺乳动物一切凋亡信号转导的共同通路，正常情况下以无活性的酶原形式存在于细胞浆中，Caspase的激活被认为是进入凋亡途径的特异性标志，其中Caspase-3是细胞凋亡过程中最重要的终末执行酶^［15］。
    维生素B12作为体内重要的元素之一，参与体内各种代谢活动，是机体重要的抗氧化剂^{［5-6，16］}。研究表明维生素B12对周围神经有很好的保护作用，王东强等^［7］发现维生素B12可以加快受损伤轴突的生长速度，延缓失去神经支配肌肉的萎缩，促进周围神经损伤后的功能重建。本实验通过建立糖尿病大鼠模型，给予大鼠维生素B12灌胃治疗，观察维生素B12对糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡的影响，并探讨其作用机制。
    在本研究中，于第10周末将所有大鼠处死，制备视网膜石蜡切片，并进行TUNEL凋亡标记。通过显微镜观察发现，DM组和VitB12组大鼠在视网膜神经节细胞层、内核层和外核层均可见凋亡细胞，且数量明显多于NC组大鼠。有研究表明16周以前是糖尿病视网膜病变的背景期，而视网膜的血管内皮细胞出现凋亡则主要是在24周以后或是更晚^［17］。
    本研究结果证实了糖尿病视网膜神经元病变发生早于视网膜微血管病变。本实验还发现，DM组和VitB12组丙二醛含量高于NC组，而DM组和VitB12组超氧化物歧化酶活性低于NC组。其中丙二醛反映氧化损伤水平^［18］，超氧化物歧化酶活性代表抗氧化水平^［19］。这提示糖尿病大鼠血清中活性氧簇生成增多，抗氧化防御能力下降，提示氧化应激可能参与了糖尿病大鼠视网膜神经细胞的凋亡。另外，本研究通过免疫组织化学法检测视网膜组织Caspase-3蛋白表达后发现，三组在视网膜神经节细胞层、内核层和外核层均可见Caspase-3蛋白表达。但是，与NC组相比，DM组和VitB12组Caspase-3蛋白表达明显增多，而且DM组和VitB12组视网膜Caspase-3光密度值高于NC组，这提示Caspase-3在糖尿病大鼠视网膜神经细胞的凋亡发生中起到一定的作用。综上结果分析，糖尿病大鼠体内过多的活性氧簇可能通过激活Caspase-3来启动视网膜神经细胞的早期凋亡。
    在本实验中，VitB12组用维生素B12灌胃治疗8周，NC组和DM组用等体积生理盐水替代治疗，对比分析结果发现：DM组、VitB12组丙二醛含量高于NC组，DM组高于VitB12组；DM组、VitB12组超氧化物歧化酶活性低于NC组，DM组低于VitB12组。这表明VitB12组大鼠在维生素B12灌胃治疗8周后，其体内的活性氧簇生成较DM组减少，抗氧化防御能力有所增强。3组大鼠视网膜神经节细胞层、内核层和外核层均可见凋亡细胞，但3组AI值有显著差异，其中 DM组、VitB12组高于NC组，DM组高于VitB12组。这表明维生素B12可以在一定程度上抑制糖尿病大鼠视网膜神经细胞的凋亡，起到保护视神经的作用。此外，3组在视网膜神经节细胞层、内核层和外核层均可见Caspase-3蛋白表达，DM组、VitB12组Caspase-3蛋白表达高于NC组，DM组高于VitB12组。这提示维生素B12在一定程度上抑制了糖尿病大鼠视网膜Caspase-3蛋白的表达。以上结果说明维生素B12可能通过其抗氧化作用降低Caspase-3蛋白的表达，抑制糖尿病大鼠视网膜神经细胞的凋亡，从而达到保护视神经的作用。
    综上所述，维生素B12对糖尿病视网膜神经细胞有一定的保护作用，维生素B12虽然不是最强的抗氧化剂，但其无明显的副作用，已在临床广泛应用于治疗周围神经病变。维生素B12在糖尿病视网膜病变视神经保护方面有较好的临床应用前景，有望成为早期干预和治疗糖尿病视网膜病变的一种临床常规用药。