《眼科新进展》  2017年11期 1027-1031   出版日期：2017-11-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
siRNA靶向沉默载脂蛋白2(Lcn 2)对缺氧诱导视网膜神经节细胞-5细胞凋亡的作用及机制


    青光眼已经被世界卫生组织列为第二位致盲眼病［1］。2013年，全球青光眼患者人数约为6430万，预计在2020年将增加至7600万，2040年估计增加至1亿［2］。目前临床上对青光眼的治疗普遍以降低眼压为主，多采用手术和药物保守治疗［3］，但对有些患者手术治疗的效果仍不理想［4］，因此，积极寻找防治青光眼的关键分子或者技术很有必要。
    载脂蛋白2（lipocalin 2，Lcn 2）是lipocalin超家族的一个小分子蛋白，也称中性粒细胞明胶Lcn 2［5］。研究显示，Lcn 2在青光眼小鼠视网膜及视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGC）层中表达显著升高［6-7］，但Lcn 2对缺氧诱导RGC-5凋亡的作用尚未见报道。本研究采用siRNA沉默Lcn 2探讨其对缺氧介导的RGC-5细胞凋亡的作用及可能机制，为Lcn 2在眼科疾病中的研究奠定理论基础。
1　材料与方法
1.1　材料　RGC-5细胞（ATCC公司，美国）；DMEM培养基及胎牛血清（Hyclone公司，美国）；细胞凋亡检测试剂盒Cell Death Detection ELISA试剂盒（罗氏，德国）；Caspase-3活性检测试剂盒Caspase-3/CPP32 Fluorometric Assay Kit（BioVision，美国）；反转录试剂盒（Promega，美国）；SYBR Green PCR Master Mix试剂盒（Qiagen，德国）；Lcn 2抗体（RD公司，美国）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved-Caspase-3，c-Caspase-3）、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（cleaved-PARP，c-PARP）、Bax、Bcl-2、细胞色素C(cytochrome C，Cyto C)抗体（CST公司，美国）；BCA蛋白浓度检测和线粒体膜电势检测（JC-1）试剂盒（碧云天，中国）；Rrizol试剂盒和DCFH-DA试剂盒（Invitrogen公司，美国）；蛋白印迹二抗（中杉金桥，中国）；Lcn 2 siRNA及阴性对照（ABI公司，美国）。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养及处理　RGC-5细胞使用DMEM培养基培养（加体积分数10%胎牛血清、10 g·L-1青霉素和链霉素），置体积分数5% CO2、37 ℃细胞培养箱中培养。每3~4 d胰蛋白酶消化传代。RGC-5细胞首先置于体积分数5% O2、5%CO2、90%N2，37 ℃分别培养4 h、8 h、12 h、24 h和48 h，检测Lcn 2的表达水平。以缺氧环境下培养24 h为诱导条件，RGC-5细胞分为4组：（1）对照组：不做任何处理的空白对照组；（2）缺氧组：细胞于缺氧环境下培养24 h；（3）siNC+缺氧组：细胞经转染siRNA阴性对照48 h后于缺氧环境下培养24 h；（4）siLcn 2+缺氧组：细胞经转染Lcn 2 siRNA 48 h后于缺氧环境下培养24 h。
1.2.2　细胞凋亡的检测　细胞接种于96孔板中，采用LipofactamineTM 2000将siNC和siLcn 2转染至细胞中48 h，然后于缺氧环境下继续培养24 h。严格按照细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，检测细胞的凋亡率。将对照组凋亡率设为100%，其他组别均为相对值。
1.2.3　Caspase-3活性检测　待各组细胞处理结束后，收集细胞，严格按照Caspase-3活性检测试剂盒说明书检测细胞中Caspase-3活性。实验结束时，用50 μL 裂解液裂解细胞10 min，加入2×反应缓冲液（50 μL）和5 μL反应底物，于37 ℃孵育1.5 h。设置多功能酶标仪的发射波长为400 nm，激发波长为505 nm，采集各组细胞荧光强度数值。
1.2.4　ROS的检测　细胞接种于6孔板中，待各组细胞处理结束后，弃培养基，采用PBS缓冲液清洗细胞3次，加入10 μmol·L-1 DCFH-DA于37 ℃孵育30 min，于倒置荧光显微镜下观察细胞ROS的产生，最后采用IPP软件对相对荧光强度进行统计分析。
1.2.5　线粒体膜电势的检测　细胞接种于6孔板中，待各组细胞处理结束后，弃培养基，加入1 mL染色工作液，于37 ℃孵箱中孵育20 min，反应结束后，用现配的染色缓冲液洗涤2次，加入2 mL细胞培养液，荧光显微镜下观察并统计线粒体膜电势的变化。
1.2.6　实时定量PCR检测　采用Trizol试剂按照说明书操作提取细胞总RNA，并测定浓度，5 μg反转录合并cDNA，采用SYBR Green试剂盒检测Lcn 2的mRNA水平，反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min，循环30次。每组设3个复孔。Lcn 2的引物序列为：正向：5’-GACTCAACTCAGAACTTGATCCCT-3’，反向：5’-AGCTCTGTATCTGAGGGTAGCTGT-3’；β-actin的引物序列为：正向：5’-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3’，反向：5’-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3’。
1.2.7　Western blot测定Lcn 2等蛋白表达　提取各组细胞总蛋白，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度，各孔50 μg上样量进行SDS-PAGE电泳，转膜。50 g·L-1脱脂牛奶室温封闭1 h，加入一抗后，于 4 ℃ 孵育过夜。洗涤后加入二抗室温孵育1 h，漂洗后显色，在暗室进行显影和定影，扫描后采用ImageJ分析各个条带的光密度值。
1.3　统计学处理　采用SPSS 13.0统计学软件处理数据，数据以均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　缺氧诱导Lcn 2表达上调　Lcn 2 mRNA表达水平见图1，缺氧组4 h（2.59±0.34）、8 h（2.64±0.47）、12 h（3.44±0.37）、24 h（4.26±0.29）和48 h（4.35±0.39）与0 h组（0.97±0.10）相比，Lcn 2 mRNA水平随着缺氧时间的延长逐渐升高（均为P<0.05；图1A）。此外，Western blot检测结果表明，缺氧组12 h（2.73±0.38）、24 h（3.16±0.28）和48 h（3.66±0.30）与0 h（1.01±0.10）相比，Lcn 2蛋白表达水平均显著上调（均为P<0.05；图1B），说明缺氧诱导Lcn 2表达上调。
2.2　沉默Lcn 2抑制细胞凋亡　四组间细胞凋亡率差异有统计学意义（F=12.43，P=0.002；图2A）；两两比较结果表明：与对照组（99.66%±2.86%）比较，缺氧组（138.33%±13.76%）显著升高（P<0.05），siLcn 2+缺氧组（105.02%±8.60%）较 siNC+缺氧组（142.33%±6.54%）显著下降（P<0.05）。四组间Caspase-3相对活性差异具有统计学意义（F=42.81，P=0.000；图2B）；两两比较结果表明：与对照组（1.03±0.06）比，缺氧组（3.59±0.41）增强（P<0.05），siLcn 2+缺氧组（2.01±0.21）较siNC+缺氧组（3.56±0.26）减弱（P<0.05）。四组间c-PARP相对蛋白表达差异有统计学意义（F=45.68，P=0.000；图2C）；两两比较结果显示：与对照组（1.22±0.05）比较，缺氧组（2.83±0.16）显著升高（P<0.05），siLcn 2+缺氧组（2.19±0.11）较siNC+缺氧组（3.15±0.28）降低（P<0.05）。四组间c-Caspase-3蛋白相对表达差异具有统计学意义（F=42.81，P=0.000；图2C）；两两比较结果表明：与对照组（1.03±0.03）比较，缺氧组（4.20±0.45）升高（P<0.05），siLcn 2+缺氧组（2.52±0.27）较siNC+"缺氧组（3.93+0.35）降低（P<0.05）。
2.3　沉默Lcn 2抑制ROS产生　四组间ROS相对荧光强度差异具有统计学意义（F=39.92，P=0.000；图3）；两两比较结果表明：与对照组（1.03±0.11）比较，缺氧组（4.26±0.63）增强（P<0.05），siNC+缺氧组（4.73±0.26）与缺氧组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。siLcn 2+缺氧组（3.10±0.24）较siNC+缺氧组ROS显著减弱（P<0.05）。





2.4　Lcn 2对线粒体凋亡通路的作用　四组间线粒体膜电势差异具有统计学意义（F=35.30，P=0.000；图4A）；两两比较结果表明：与对照组（99.35±"2.94）相比，缺氧组（46.21±6.16）减少（P<0.05）；siNC+缺氧组（38.05±9.41）与缺氧组相比，线粒体膜电势差异无统计学意义（P>0.05）；siLcn 2+缺氧组（75.67±6.54）较siNC+缺氧组增加（P<0.05）。四组间Cyto C蛋白相对表达差异具有统计学意义（F=25.42，P=0.000；图4B-4C）；两两比较结果表明：与对照组（1.01±0.14）比较，缺氧组（3.13±0.57）表达水平显著增加（P<0.05）；siNC+缺氧组（3.80±0.21）与缺氧组差异无统计学意义（P>0.05）；siLcn 2+缺氧组（2.16±0.26）较siNC+缺氧组减少（P<0.05）。四组间Bax/Bcl-2相对比率差异具有统计学意义（F=23.69，P=0.000；图4D）；两两比较结果表明：与对照组（0.95±0.12）比较，缺氧组（4.86±0.97）升高（P<0.05）；siNC+缺氧组（5.50±0.61）与缺氧组相比差异无统计学意义（P>0.05）；siLcn 2+缺氧组（2.76±0.32）较siNC+缺氧组降低（P<0.05）。



3　讨论
    本研究发现，Lcn 2随着缺氧时间的延长其mRNA和蛋白表达逐渐升高，表明Lcn 2在RGC-5细胞缺氧介导细胞损伤中可能发挥重要作用。有学者发现Lcn 2在青光眼小鼠视网膜中表达上调［6］，且在急性缺血及缺氧条件下，Lcn 2表达显著上调［8］，本研究结果与其一致，即缺氧激活Lcn 2表达。
    Lcn 2在细胞凋亡中有重要作用，有文献报道Lcn 2促进人体皮脂腺细胞［9］、心肌细胞［10］、肝癌细胞［11］凋亡。过表达Lcn 2促进神经元细胞和神经母细胞瘤细胞死亡［12］。本研究发现沉默Lcn 2缺氧诱导的细胞凋亡率下降。但是也有文献报道，Lcn 2缺失促进肝脏细胞凋亡［13］，Lcn 2抑制氧化应激介导的肺动脉平滑肌细胞凋亡［14］，表明Lcn 2在细胞凋亡中的作用取决于细胞的种类及损伤模型，这种差异可能因为Lcn 2在不同的病理条件下调控不同信号通路引起的。Caspase-3是细胞凋亡过程中早期关键的执行分子，激活的Caspase-3能够剪切细胞凋亡过程中的多种关键蛋白，其中PARP是最早鉴定出的Caspase-3的底物［15］。本研究发现，沉默Lcn 2使Caspase-3活性减弱、c-Caspase-3和c-PARP蛋白表达减少。这些结果进一步证实Lcn 2缺失抑制缺氧诱导RGC-5细胞凋亡。
    ROS是生物体需氧细胞在代谢过程中产生的一系列衍生物，包括氧离子、过氧化氢和含氧自由基等，在线粒体凋亡通路中有重要作用［16］。过量的ROS引起脂质过氧化，导致线粒体通透性转换孔打开，释放Cyto C，启动凋亡信号通路［17］。本研究发现Lcn 2缺失导致细胞中ROS显著减少，本研究结果与Wu等［18］报道一致，即Lcn 2促进ROS产生。
    Bcl-2蛋白家族在调控细胞凋亡中发挥重要作用，促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2的比例是调控凋亡的关键分子。在肝癌细胞中Lcn 2通过激活线粒体凋亡通路、上调Bax/Bcl-2诱导细胞凋亡［11］，且有研究表明，在心肌细胞中Lcn 2促进Bax向线粒体膜上转移［11］。与这些研究结果一致，本实验证实Lcn 2缺失阻碍线粒体膜电势去极化、下调Cyto C和Bax表达、上调Bcl-2表达，表明沉默Lcn 2抑制RGC-5细胞线粒体凋亡信号通路。
    综上，Lcn 2缺失抑制缺氧诱导RGC-5细胞凋亡及ROS产生，可能通过抑制线粒体凋亡信号通路实现，这一结果为Lcn 2在眼科疾病防治中奠定理论基础并为青光眼等眼科疾病的基因治疗提供新的思路。