《眼科新进展》  2017年11期 1015-1017   出版日期：2017-11-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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姜黄素对核转录因子-κB表达的影响及小鼠角膜紫外线照射损伤的抑制作用


    随着全球气候变暖以及臭氧层的破坏，紫外线辐射对人类的损伤日益加剧。紫外线对组织的损伤机制主要表现在光毒性的直接损伤以及氧化应激性的间接损伤。紫外线A（ultraviolet A，UVA）和紫外线B（ultraviolet B，UVB）的损伤作用与眼部的翼状胬肉、白内障等发生密切相关^［1-3］。以往的研究多集中于UVB，UVB可引起细胞DNA直接损伤，导致组织产生一系列炎症因子并激活信号通路，从而引起细胞及细胞外基质受损。而UVA的损伤机制与UVB不同，角膜可透过较多的UVA，UVA的损伤机制是近几年眼表紫外线损伤研究新的热点^［4］。
    有研究表明，UVA照射产生膜氧化应激能够激活核转录因子-κB （nuclear factor-κB，NF-κB），而NF-κB的激活是多种下游因子激活和损伤加剧的关键环节。大量的研究表明，姜黄素具有抑制NF-κB活性的作用^［5-9］。本次我们探讨姜黄素对UVA照射小鼠角膜的保护作用。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验动物及分组　取C57 BL/6小鼠30只，体质量18～22 g，鼠龄5周，雌雄不限（南京总医院动物实验中心提供）。实验前经裂隙灯检查排除眼前节疾病，采用随机数字表法将小鼠分为对照组、UVA照射组、姜黄素干预组，每组10只。UVA照射组按45 mg·kg^-1小鼠腹腔内注射5 g·L^-1戊巴比妥钠进行麻醉；小鼠头部固定后，双眼接受位于前上方的 UVA 照射；UVA光源来自Daavlin紫外光发射器 （德国），发射波长为 320～400 nm，照射强度为 0.05 W·cm^-2，照射距离固定，照射强度稳定，照射时间24 h。姜黄素干预组在UVA照射前3 d给予小鼠姜黄素30 mg·kg^-1腹腔内注射，并持续至照射后48 h。对照组不作任何处理。
1.1.2　主要试剂及仪器　PBS（美国GIBCO公司），生物素标记电泳迁移率实验探针NF-κB（上海碧云天生物技术有限公司），NF-κB p65 （D14E12） XP兔多抗（美国Cell Signaling Technology公司）；Allegra 21 R台式高速冷冻离心机（美国 BECKMAN 公司），台式高速离心机（德国SORVAL公司），320-S pH 计（美国Mettler Toledo公司），AR5120电子天平（美国AHOMS公司），MultiTemp III 恒温水浴锅，雪花状制冰机（日本 SANYO公司），超净工作台（中国苏净集团），NanoDrop2000超微量分光光度计（美国Thermo公司）。
1.2　方法
1.2.1　小鼠角膜混浊的临床评分　在紫外线照射后6 h、24 h及48 h对各组小鼠角膜进行裂隙灯检查，对小鼠角膜混浊进行临床评分并行前节照相。裂隙灯下角膜混浊分级参照Haze的分级标准：0级为完全透明；0.5级为仅在裂隙灯非直接光照下可分辨极轻微的混浊；1级为在直接和弥散光照下可看到轻微混浊；2级为较容易看出的混浊；3级为密度较高的混浊，不易看清眼内结构如虹膜和视网膜；4级为角膜完全混浊。
1.2.2　小鼠角膜NF-κB表达的测定　（1）使用核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒NE-PER提取核蛋白：将小鼠角膜组织剪碎，放入离心管PBS冲洗，500 r·min^-1 4 ℃离心 5 min，弃上清。加入预冷的 CER I（含蛋白酶抑制剂）100 μL，剧烈振荡15 s，冰浴 10 min。加入预冷的 CER II 5.5 μL，剧烈振荡5 s，冰浴 1 min。再次剧烈振荡5 s，10 000 r·min^-1离心 5 min，立即吸取上清置于预冷的离心管中，即为抽取得到的细胞浆蛋白。加入预冷的NE-PER（含蛋白酶抑制剂）40 μL，剧烈振荡15 s，置冰上，每10 min 剧烈振荡15 s，共 40 min，10 000 r·min^-1离心 10 min，立即吸取上清置于预冷的离心管中，即为细胞核蛋白。（2）利用电泳迁移率实验测定NF-κB的表达：以5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’、3’ -TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5’为序列制备电泳迁移率实验探针；配制60 g·L^-1非变性聚丙烯酰胺凝胶；按电泳迁移率实验/Gel-Shift试剂盒说明书进行电泳迁移率实验结合反应；按照10 V的电压预电泳10 min。把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内；在多余的某个上样孔内加入10 μL稀释好的Gel-Shift上样缓冲液（蓝色），用于观察电泳进行的情况；电泳至Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料到达胶的下缘1/4处，停止电泳；转膜后，用X光片压片检测，实验重复3次。
1.3　统计学分析　采用SPSS 17.0统计学软件进行分析。角膜混浊临床评分采用Wilcoxon秩和检验；定量资料以x?±s表示，进行方差齐性检验，多组资料之间的比较采用ANOVA方差分析，组间两两比较采用LSD法。P<0.05 为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　UVA照射后小鼠角膜损伤的情况　UVA照射后小鼠角膜出现轻度的上皮点状剥脱及基质水肿，24 h达到高峰。姜黄素干预组角膜仅出现上皮下的轻度混浊，基质水肿不明显（图1）。照射后48 h，UVA照射组角膜混浊临床评分（3.10±0.74）分均高于对照组（0分）及姜黄素干预组（0.35±0.24）分。两两比较发现对照组与姜黄素干预组间角膜混浊临床评分差异无统计学意义（P>0.05）；UVA照射组与对照组以及姜黄素干预组间差异均有统计学意义（均为P<0.05）。
2.2　各组小鼠角膜NF-κB的表达　照射后48 h，角膜组织NF-κB表达水平对照组（1.25±0.13）与姜黄素干预组（1.58±0.34）均较低，UVA照射组（3.98±0.58）明显升高。两两比较发现对照组与姜黄素干预组角膜组织NF-κB表达水平差异无统计学意义（P>0.05）；UVA照射组与对照组以及姜黄素干预组间差异均有统计学意义（均为P<0.05，图2）。




3　讨论
    紫外线可促使氧自由基形成，氧自由基通过中和细胞的抗氧化物质而导致细胞损害。UVA和UVB照射眼部会引起角膜变性、翼状胬肉、白内障等疾病。以往的研究多集中于UVB，因为它产生的生物学效应远远超过UVA，UVB导致皮肤癌发生的作用比UVA大800~1000倍。有研究发现，眼表疾病翼状胬肉的发生率与UVB（290~320 nm）、UVA1 （320~340 nm）及UVA2 （340~400 nm）三个波长紫外线辐射量的相关性分别为0.65 （95%置信区间0.33~0.98）、0.82 （0.45~1.19）和 0.86 （0.48~1.25）。计算机模拟实验也显示，鼻侧角膜缘接受光强度为颞侧角膜缘的20倍，对于UVA波长的光尤为明显。并且，角膜能够透过较多的UVA（80% 400 nm，60% 320 nm），因此，UVA与UVB一样，对于翼状胬肉的发生也起着重要作用^［10-11］。
    研究表明，UVA照射可产生膜氧化应激反应，氧化应激反应能够激活NF-κB，NF-κB活化是多种下游因子激活和损伤加剧的关键环节。NF-κB广泛存在于各种细胞内，是转录调节因子。正常情况下，NF-κB与移植蛋白单体IkB结合以无活性的方式存在于细胞中，当细胞受到刺激时，二者分离，NF-κB进入细胞核，与特定靶基因结合，调节与应答相关的基因表达，导致肿瘤的侵袭和转移。大量研究表明，姜黄素具有抑制NF-κB活性的作用，被称为是NF-κB的天然抑制剂^［12-20］。本研究发现，UVA照射后姜黄素干预组小鼠角膜损伤程度比单纯UVA照射组轻，并且姜黄素可抑制NF-κB的表达。
    进一步的研究可扩大样本量，观察UVA照射及姜黄素作用的时间剂量效应，并检测与NF-κB活化相关的上下游因子，从而更深入探讨姜黄素的作用机制。