《眼科新进展》  2017年10期 939-942   出版日期：2017-10-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
年龄相关性白内障患者沉默信息调节因子1（SIRT1）的单核苷酸多态性研究


    年龄相关性白内障（age-related cataract，ARC）是全球最常见的致盲和视力损害的眼病［1］。尽管其确切的发病机制还未阐明，但晶状体上皮细胞DNA损伤后修复不全可能是其重要的发病机制之一。有研究发现，白内障是由表观遗传学与基因改变共同引起的，许多晶状体上皮细胞中DNA氧化损伤基因的甲基化及乙酰化修饰会导致白内障的形成已引起了广泛的关注和研究［2］。这种乙酰化修饰主要由组蛋白乙酰化酶（histone acetylase，HAT）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）来分别催化蛋白质的乙酰化和去乙酰化作用，从而调控生命活动的分子转录。有研究表明，一种去乙酰化酶即沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）在年龄相关疾病中可能具有重要保护性作用［3］。近期研究发现，碱基切除修复通路关键分子即8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1（8-oxoguanine DNA glycosylase 1，OGG1）在ARC晶状体上皮细胞中乙酰化水平的下降可能是由于SIRT1与OGG1相互结合能力的增强所致［4］。本研究旨在研究SIRT1基因5个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点（rs2236319、rs1885472、rs10997868、rs2273773、rs4746720）与江苏汉族人群ARC的关联。
1　资料与方法
1.1　一般资料　ARC组收集“江苏眼病研究”苏南无锡市滨湖区、苏北盐城市阜宁县流行病学人群ARC确诊患者［5］：年龄50~80岁；最佳矫正视力<0.5；LOCSⅢ晶状体混浊；四代内均为汉族。排除其他类型白内障、外伤、近视、青光眼、视网膜脱离等眼部疾病以及糖尿病、高血压、心血管疾病等氧化损伤相关的全身性疾病，ARC组共收集患者720例（其中皮质性ARC 384例，核性ARC 215例，后囊下性ARC 50例，混合性ARC 71例）。对照组（701例）：同样来自上述“江苏眼病研究”盐城市阜宁县流行病学人群。纳入标准：年龄50~80岁；最佳矫正视力≥0.5；晶状体透明；无ARC病史，无明显眼部病变及全身性疾病；四代内均为汉族。按性别、年龄与病例组频数匹配。在知情同意的情况下，采集外周静脉血。本研究通过南通大学附属医院伦理委员会批准。ARC组患者年龄（69.26±5.89）岁，男274例，女446例；与对照组年龄（68.68±5.32）岁、性别（对照组：男307例，女394例）比较，差异均无统计学意义（P=0.053、0.833）。
1.2　方法
1.2.1　研究对象的外周淋巴细胞基因组DNA制备　采用经典的酚-氯仿-异戊醇法提取外周血淋巴细胞基因组DNA。利用GeneQuant100分光光度计（美国GE公司）测定DNA浓度及纯度（A260/A280约1.8，＜1.6表明有蛋白质、酚等污染，＞1.9表明有RNA污染），符合扩增要求，将所有DNA样本浓度均稀释为50 mg·L-1，保存于-20 ℃。
1.2.2　SIRT1基因SNP位点的选择　通过dbSNP数据库网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp）获得SIRT1基因SNP位点基因型数据。登陆生物信息学网站（http：//archive.broadinstitute.org/mpg/snap/ldsearch.php）分析并筛选出上述SNP的高度连锁不平衡位点。遵循以下原则：（1）中国汉族人群中，稀有等位基因频率≥10%；（2）排除存在高度连锁不平衡性的突变位点（r2≤0.8）。排除高度连锁不平衡后，最终选择了5个SNP进行关联研究（表1）。
1.2.3　SIRT1基因SNP分型分析　采用Taqman探针进行SIRT1基因SNP分型分析。体外扩增SIRT1基因SNP位点，反应体系10 μL，取5 μL的 2×PCR反应液，0.5 μL DNA模板，0.2 μL Taqman探针，4.3 μL去离子水。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共40个循环。使用7500型实时定量PCR仪（美国ABI公司）检测以两个探针荧光信号分别对应两种不同的等位基因。每次检测设4个空白对照。



1.3　统计学方法　应用Stata/SE 11.0统计软件程序进行统计分析。该研究中计量资料表示为均数±标准差。用卡方检验来检验对照组、ARC组及各型ARC的等位基因频率之间的关联，以及计算各基因型的哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）。用Bonferroni校正来进一步对等位基因分析中发现的任何阳性结果进行校正，以控制Ⅰ类错误概率。所有检验都为双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　HWE检验结果　除rs10997868外，其余SIRT1基因SNP位点在对照组和ARC组的各基因型实际频数与理论频数之间差异无统计学意义（P>0.05），均符合HWE定律，因此在结果分析当中排除SIRT1- rs10997868。
2.2　对照组和ARC组SIRT1基因SNP位点等位基因频率分布　4组SIRT1基因SNP位点等位基因的分布与比较见表2。SIRT1基因rs2236319、rs1885472、rs2273773、rs4746720位点稀有等位基因在对照组与ARC组等位基因频率分布比较，差异均无统计学意义（P=0.11、0.44、0.50、0.85）。
2.3　对照组和ARC组SIRT1基因SNP位点基因型频率分布　SIRT1基因rs2236319位点的AA与AG、AA与GG的频率在对照组与ARC组间差异均无统计学意义（P=0.10、0.19）。位点rs1885472的CC与CG、GG与CC的频率在对照组与ARC组间差异均无统计学意义（P=0.25、0.45）。位点rs2273773的CC与CT、CC与TT的频率在对照组与ARC组间差异均无统计学意义（P=0.46、0.44）；位点rs4746720的CC与CT、CC与TT的频率在对照组与ARC组间差异均无统计学意义（P=0.14、0.53，见表3）。




3　讨论
    ARC是常见的年龄相关性慢性疾病，其确切病因和发病机制尚不清楚，是一个多基因、多阶段、多因素参与作用的复杂过程。但目前普遍认为遗传因素和环境因素相互作用在ARC的发生发展中起着重要作用。与ARC关联的遗传因素的探究一直是研究热点，尤其是外显子区与内含子区的SNP［5］。已有研究发现，DNA甲基化酶及组蛋白乙酰化酶可以调控DNA修复基因的甲基化及乙酰化，进而在ARC晶状体上皮细胞中参与调控DNA修复基因的表达，影响ARC进程［6］。组蛋白修饰是第二类最常见的表观遗传调节机制，许多蛋白质的乙酰化水平因为在白内障的发生发展过程中起到一定的作用而受到广泛的关注和研究［7］。蛋白质乙酰化是指蛋白质赖氨酸残基上添加乙酰基的过程，而此过程主要由乙酰基转移酶和去乙酰化酶共同调节完成，因为这些酶最初被发现时是作用于组蛋白的，因而分别被命名为HATs和HDAC［8］。
    SIRT1是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖的蛋白去乙酰化酶，属于Ⅲ类HDACs，是HDACs中研究最为深入的一种蛋白，可以介导多种生理过程，包括氧化应激、基因稳定、细胞凋亡和自噬等［9］。已有许多研究表明，SIRT1基因的SNP与许多年龄相关性疾病有关，包括心脑血管疾病等［10］。另外，本研究及国内其他学者研究已证实SIRT1基因在ARC患者的晶状体上皮细胞中表达是明显增高的，提示SIRT1在ARC的发生发展过程中可能发挥一定的作用［4，11］。因此，我们猜测SIRT1基因的SNP可能与ARC的发生有关。先前的研究较多集中于编码区的SNP，近年来研究的热点转向基因 3’UTR区的SNP。
    本研究中选择SIRT1基因的5个SNP位点中，3个定位于内含子区（rs2236319、rs1885472、rs10997868），1个定位于外显子区（rs2273773），1个定位在3’UTR区（rs4746720）。LAGOUGE等［12］研究发现，在芬兰人群中rs2236319位点与2型糖尿病患者的体质量正常有关。MAEDA等［13］研究也发现在日本人群中该位点与糖尿病肾病显著相关。HELISALMI等［14］对芬兰人的一项病例对照研究未发现该位点与阿尔茨海默病患病相关，在本研究中也未能发现该位点与ARC的发病有关，FLACHSBART等［15］研究未发现rs1885472与德国人群长寿相关，在本研究中也未发现该位点与ARC的发病有关联。CURJURIC等［16］对瑞士人群的队列研究未发现rs10997868与肺功能有关，在本研究由于该位点涉及的人群中不符合HWE定律，所以未能进一步研究该位点与ARC发病之间的关联。FLACHSBART等［15］研究发现rs2273773与德国人群长寿无关。荷兰的一项研究也没有发现rs2273773与荷兰白种老年人长寿相关［17］。国内的研究者研究也发现rs2273773与广西某地区人群长寿无关［18］。SHIMOYAMA等［19-20］先后报道了rs2273773与日本男性中年人高血压、血脂及动脉钙化相关。但在本研究中未能发现该位点与ARC的发病有关联。本研究中选择的rs4746720位点是SIRT1基因 3’UTR区的SNP，是目前研究的热点，该部位的SNP是microRNA的潜在结合位点，可以调控目标基因的表达。MAEDA等［13］研究发现在日本人群中rs4746720与糖尿病肾病显著相关。国内有学者报道该位点广西某地区人群长寿相关［18］。在本研究中未能发现该位点SNP与ARC有关联。
    本研究选择的研究对象来源于“江苏眼病研究”苏南无锡市滨湖区、苏北盐城市阜宁县流行病学人群，未发现SIRT1基因的4个位点与ARC发病关联，说明SIRT1基因可能不参与江苏汉族人群ARC的发生发展，这可能与仅考虑该基因遗传因素有关。我们后续将进一步扩大人群样本量，同时收集其环境因素，综合环境因素加以分析，为进一步深入探讨ARC可能的分子机理提供重要的理论依据。