《眼科新进展》  2017年10期 926-930   出版日期：2017-10-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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沉默信息调节因子相关酶1（SIRT1）调控p38MARK信号通路对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜神经节细胞的保护作用及机制


    糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病常见且严重的眼部并发症，不仅是发达国家成年人致盲的主要原因，也是我国成年人致盲的主要原因^［1-2］。目前认为DR是一种神经血管性病变，神经组织的损伤出现在微血管系统病变前，其病理特征包括神经元凋亡、神经胶质细胞活跃及内层视网膜变薄^［3-4］。细胞凋亡是糖尿病大鼠视网膜神经元损害的主要形式。由于神经组织损伤后的再生能力较差，目前越来越多的研究开始关注神经保护在DR治疗中的重要作用^［5-6］。
    沉默信息调节因子相关酶1（silment information regulator factor related enzymes 1，SIRT1）是依赖NAD作用于组蛋白的去乙酰化酶，与DR发病相关。可通过抑制炎症反应，抑制氧化应激对视网膜细胞造成的损伤作用，影响血管内皮生长因子的表达，抑制视网膜细胞凋亡，从而影响DR的发病及进展^［7］，但其具体机制尚不明确。p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）信号通路是介导细胞反应的重要信号系统，在DR的形成及发展中起着非常重要的作用，其介导的凋亡信号转导直接参与DR的发生发展^［8］。
    本实验通过建立大鼠糖尿病模型，给以SIRT1激动剂白藜芦醇，观察糖尿病大鼠视网膜SIRT1、p38 MAPK和Caspase-3蛋白表达的变化及视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）凋亡情况，旨在探讨SIRT1对DR的神经保护作用及其可能机制，为DR的临床治疗提供理论依据及思路。
1　材料与方法
1.1　材料　取健康清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠60只，体质量200~250 g，2~3个月龄（广州中山大学动物中心提供），排除眼部疾患。实验动物的使用遵循ARVO声明。
    主要实验仪器及试剂：全自动正立荧光显微镜（德国Zeiss公司），One Touch II型血糖仪（美国堡灵曼公司），SIRT1和p38 MAPK抗体（英国Abcam 公司），Caspase-3抗体（美国CST公司），白藜芦醇（美国Sigma公司），链脲佐菌素（迈新生物技术开发公司），TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（美国Promega公司）。
1.2　糖尿病大鼠模型的制备及分组　所有大鼠适应性喂养1周后，应用随机数字表法分为正常对照组（正常组）、糖尿病组（病变组）、SIRT1激动剂白藜芦醇治疗组（治疗组），每组20只。禁食12 h，称体质量，将链脲佐菌素溶解于0.1 mol·L^-1枸橼酸钠溶液（pH=4.5），病变组和治疗组大鼠按60 mg·kg^-1单次腹腔注射链脲佐菌素以诱导糖尿病大鼠模型；正常组按60 mg·kg^-1腹腔注射枸橼酸钠缓冲液。72 h后取鼠尾静脉血检测血糖，血糖值>16.7 mmol·L^-1定为糖尿病大鼠。自造模成功后第2天起治疗组每天每只鼠给予白藜芦醇20 g·kg^-1灌胃，正常组和病变组每天每只鼠给予亚甲砜灌胃。
    模型建立后每周1次测大鼠血糖、体质量，同时记录饮食、饮水量、精神状态等变化情况。分组饲养8周后，在末次给药第2天腹腔内注射100 mg·kg^-1水合氯醛进行麻醉后，处死大鼠，取出双眼眼球，进行检测。
1.3　视网膜免疫组织化学染色　常规石蜡切片，脱水，加山羊血清封闭抗体。加1∶100比例稀释的一抗和生物素化的二抗，DAB显色，苏木素复染。观察视网膜形态结构。
1.4　TUNEL法检测视网膜RGCs凋亡情况　常规制备视网膜石蜡切片，按照试剂盒说明书操作步骤进行，Mounting media封片剂封片，阴性对照不加TdT酶，其余步骤与之相同。全自动正立荧光显微镜观察。计数RGCs凋亡数：每个标本抽取连续3张切片，每张切片连续读取5个高倍视野，计数每个视野中的TUNEL阳性细胞（绿色）数，取其均数作为该只大鼠RGCs的凋亡细胞数，计算凋亡指数=（凋亡细胞数量/细胞总数量）×100%。
1.5　Western blot检测SIRT1、p38 MAPK、Caspase-3蛋白的表达　制备视网膜组织匀浆，经SDS-PAGE电泳后将蛋白转至PVDF膜上，加入相应的一抗Caspase-3（1∶500）、SIRT1（1∶1000）、p38 MAPK （1∶200），4 ℃孵育过夜。用HRP标记二抗（1∶1000），室温下孵育1 h后，进行化学发光显影（ECL显色）。采用Image J分析目标条带的光密度值。以GAPDH（1∶5000）作为内参照，比较不同处理后目的蛋白表达的差异，结果由计算机凝胶图像分析系统分析。
1.6　统计学分析　采用SPSS 13.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（x?±s）表示，组间均数经Bartlette检验方差齐。多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　体征情况　实验期间，正常组大鼠状态良好、健壮、皮毛油亮有光泽，自主活动正常，对外界反应灵敏，全部存活。与正常组大鼠相比较，链脲佐菌素造模2周后，大鼠渐显消瘦，精神萎靡，皮毛无光泽，多饮、多食及体质量减轻。病变组有2只大鼠死亡，治疗组有1只大鼠死亡。
2.2　免疫组织化学检测结果　正常组大鼠视网膜各层细胞层次清楚、细胞形态完好，排列整齐，无RGCs凋亡或可见少量RGCs凋亡。病变组大鼠视网膜内外核层界限模糊，细胞排列稀疏紊乱，可见RGCs减少，神经纤维层水肿。治疗组大鼠视网膜组织各层结构较正常组略疏松，RGCs数减少 （图1）。



2.3　RGCs凋亡的观察　凋亡阳性细胞的细胞核被特异性染成绿色，而未发生凋亡的细胞核复染为蓝紫色。正常组大鼠视网膜各层未见凋亡阳性染色或见少许凋亡阳性染色；与正常组相比，治疗组大鼠视网膜阳性染色增加，但低于病变组，总体差异有统计学意义（F=670.497，P=0.000）。进一步两两比较：正常组RGCs凋亡指数（0.848±0.131）%与病变组（19.038±1.327）%、治疗组（10.461±1.089）%间差异均有统计学意义（均为P=0.000）；治疗组与病变组间差异亦有统计学意义（P=0.000，图2）。



2.4　大鼠视网膜SIRT1、p38 MAPK、Caspase-3蛋白表达情况　Western blot检测结果：各组视网膜相关蛋白表达情况见图3和表1。与正常组相比，病变组和治疗组大鼠视网膜SIRT1蛋白表达降低，总体差异有统计学意义（F=1310.663，P=0.000）。进一步两两比较，病变组和治疗组与正常组间，以及病变组与治疗组间差异均有统计学意义（均为P=0.000）。病变组和治疗组大鼠视网膜p38 MAPK、Caspase-3蛋白表达均较正常组明显增加，总体差异有统计学意义（F=604.500、1056.709，P=0.000、0.000）。进一步两两比较：p38 MAPK、Caspase-3蛋白表达在正常组与病变组间、正常组与治疗组间以及病变组与治疗组间差异均有统计学意义（均为P=0.000）。




3　讨论
    DR是成年人致盲的重要原因之一。越来越多的研究发现早在微血管病变之前，已经出现视网膜神经病变，主要是内层视网膜神经元RGCs的病变^［9］，是患者视力受损、视力下降的重要原因。作为视觉转导通路中的枢纽，RGCs数量和功能的改变在DR发病中的作用尤为重要，早期有效地抑制RGCs的受损及凋亡是遏制DR的发生和发展以及保护糖尿病患者视功能的关键^［10］。由于RGCs对细胞损伤和神经毒性作用高度敏感，为糖尿病视网膜早期病变提供了一个非常有效的检测对象。
    SIRT1是一种细胞代谢辅酶NAD依赖的组蛋白脱乙酰基蛋白酶，作为一种广泛参与细胞能量代谢、周期控制和免疫应答等生命过程的重要蛋白，SIRT1具有明显的神经元保护作用。在培养的Alzheimer病、多发性硬化以及谷氨酰胺中毒的组织模型中，过表达SIRT1可阻止神经元的死亡^［11］。在模拟多发性硬化的动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎中，SIRT1表现出明显的视神经保护作用，表明SIRT1活性的提高对小鼠自身免疫性脑脊髓炎的RGCs具有直接保护作用^［12］。白藜芦醇是非黄酮类多酚化合物，是SIRT1的天然激动剂，有研究认为白藜芦醇能够降低氧化应激和炎症反应，显著提高SIRT1酶活性^［13］，并通过别构调节提高乙酰化底物的亲和力^［14］。这些研究证实SIRT1及其激动剂白藜芦醇具有明显的抗氧化应激作用，可避免高糖、高脂诱导的氧化应激损伤，从而在糖尿病及其并发症的防治中发挥重要作用。LI等^［15］研究发现在链脲佐菌素诱导的急性糖尿病大鼠中，Caspase依赖的凋亡途径是RGCs凋亡的主要方式。Caspase-3蛋白在糖尿病大鼠的视网膜表达增加，说明DR时凋亡程序被激活而促进RGCs凋亡^［16］。糖尿病大鼠视网膜RGCs的凋亡指数明显高于正常组，且凋亡指数的增加随着病程的延长呈时间依赖性改变^［17］。本研究发现糖尿病大鼠给予SIRT1激动剂白藜芦醇干预后，一方面，大鼠视网膜Caspase-3蛋白表达降低，RGCs凋亡减少，进一步揭示了SIRT1激动剂白藜芦醇能有效地保护RGCs；另一方面，Caspase-3蛋白表达降低，可能也间接揭示SIRT1激动剂干预后改善了RGCs的功能，表现出良好的保护作用。
    p38 MAPK信号转导通路是介导细胞反应的重要信号系统，是一种应激反应通路，它可被不同的外部与细胞内刺激所激活。活化的p38 MAPK进入细胞核内，引发细胞产生炎症或免疫反应，或者导致细胞周期停滞、衰老、凋亡等^［18］。其调控凋亡的机制非常复杂，至少通过以下途径：增强c-myc表达，磷酸化P53，参与Fas/Fasl介导的凋亡，激活c-jun和c-fos，诱导Bax转位等。在NO通过刺激Bax流入线粒体而导致神经元细胞凋亡的过程中，p38 MAPK的活化起到关键作用；p38 MAPK亦可增强TNF-α表达，进而TNF-α活化p38 MAPK诱导凋亡^［19］。李永浩等^［20］研究发现p38 MAPK抑制剂SB203580能够减轻鼠糖尿病早期血视网膜屏障的破坏和RGCs凋亡，提示p38 MAPK信号通路在糖尿病早期对DR的发展起着一定的作用。
    高血糖是p38 MAPK的激活剂，高糖环境下氧化应激增强，促进周细胞凋亡。SIRT1可以通过组蛋白脱乙酰基作用，发挥抗凋亡和抗氧化应激的作用^［21］。我们的实验发现，糖尿病大鼠视网膜p38 MAPK磷酸化水平升高，Caspase-3蛋白表达增加，提示p38 MAPK通路被激活，RGCs凋亡增加。给予SIRT1激动剂白藜芦醇治疗后，p38 MAPK磷酸化水平有所降低，Caspase-3蛋白表达下降，糖尿病早期RGCs的凋亡减少，提示SIRT1激动剂白藜芦醇可能是通过抑制p38 MAPK通路的激活，减少糖尿病大鼠视网膜Caspase-3阳性神经节细胞凋亡，从而发挥神经保护作用。
    综上所述，由于DR所致的盲常常难以逆转，所以对于DR发病机制研究尤其重要。在我们的实验中，通过建立DR模型，早期应用 SIRT1激动剂白藜芦醇可提高SIRT1酶的活性而改善和延缓 DR 的发展，对DR RGCs起到保护作用，其抗凋亡作用机制可能与其抑制p38 MAPK的表达相关。p38 MAPK信号通路是DR中SIRT1介导的神经保护作用的重要通路之一，这可能为临床治疗早期DR提供了一种新的途径。