《眼科新进展》  2017年9期 824-827   出版日期：2017-09-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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树鼩茄病镰刀菌性角膜炎房水中Th1/Th2炎性因子的变化


    真菌性角膜炎在感染性角膜溃疡中发病率最高^［1-2］，并已成为首要的致盲性角膜疾病^［3］。茄病镰刀菌及曲霉菌是丝状真菌性角膜炎的主要致病菌^［4-5］。研究发现^［6-7］，真菌性角膜炎是病原菌和宿主共同作用的结果：免疫反应一旦开始即使去除抗原成分，反应也仍会继续进行；在病程发展过程中，真菌并非持续存在，在疾病早期病原体通过侵袭力、毒力、多种酶类及黏附机制致病，感染后的进一步损伤则是由宿主免疫反应及过强的炎症反应所致而非病原菌。因此研究炎症反应及其参与的炎性因子对真菌性角膜炎发病机制的阐述有重要作用。树鼩角膜大小适中、易于观察，结构与人类相近，而且与啮齿类动物相比，其与人类亲缘关系更近。因此，本实验使用树鼩构建发病率最高的茄病镰刀菌性角膜炎，检测病程不同阶段白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-4、IL-10的表达变化及角膜炎病理特点。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验动物　清洁级树鼩40只，年龄4～6个月，体质量（130±10）g，雌雄不限，由中国科学院昆明动物研究所提供。随机分为实验组30只和对照组10只，均取右眼为实验眼，实验方案通过昆明医科大学伦理委员会审批。
1.1.2　茄病镰刀菌　茄病镰刀菌购于美国ATCC公司（ATCC36031），分离自患者，培养于沙堡氏葡萄糖琼脂培养基（法国梅里埃）。
1.1.3　主要仪器及试剂　手术显微镜（苏州六六 YZ20T9）；流式细胞仪（FACSCanto II，美国BD公司）；低温高速离心机（Contifuge Stratos，德国Heraeus 公司）。人Th1/Th2细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10）试剂盒（美国BD公司）。
1.2　方法
1.2.1　真菌孢子制备方法　将茄病镰刀菌接种到沙堡氏葡萄糖琼脂培养基中，置于26 ℃培养箱7 d。10 g·L^-1亚甲基蓝染色镜下观察菌丝及孢子形态。于生物安全柜内使用生理盐水10 mL反复冲洗培养皿菌丝表面，收集真菌混悬液，无菌脱脂纱布8层过滤菌丝，血细胞计数板调整孢子密度为10×109 CFU·mL -1。
1.2.2　造模　10 g·L^-1戊巴比妥钠注射液（50 mg·kg^-1）肌肉注射树鼩麻醉后，碘伏消毒术眼3遍，盐酸奥布卡因眼液表面麻醉，聚维酮碘1 mL冲洗术眼结膜囊，实验组用胰岛素针头从角膜缘进针至角膜基质中央，深度约1/2处注入孢子混悬液50 μL；对照组注入生理盐水50 μL。统计造模成功率。
1.2.3　角膜炎等级评分　0分：角膜透明或轻度混浊，病灶部分或全部遮盖瞳孔区；1分：角膜轻度混浊，病灶部分或全部遮盖眼前段；2分：角膜浓厚混浊，病灶部分或全部遮盖瞳孔区；3分：角膜浓厚混浊，病灶覆盖眼前段；4分：角膜穿孔。
1.2.4　抽取房水　于造模后第3天、第7天、第14天，肌肉注射麻醉树鼩后，消毒，1 mL注射器角膜缘进针入前房，收集房水0.15~0.20 mL，转移到1 mL EP管中，标记并存放于-80 ℃备用。
1.2.5　流式细胞术微球阵列法检测细胞因子浓度　造模后第3天、第7天、第14天，取连续倍比稀释的标准品和待测样品（即房水，样品量为50 μL），严格按照试剂盒说明书完成样品孵育步骤。按每个待测样品每种微球1 μL的量吸取8 种捕获微球混匀，成为混合捕获微球，取标准品和待测样品各50 μL，分别加入到相应的试管中，每管加入50 μL混合捕获微球，充分混匀，室温避光1 h，然后每管分别加入50 μL 检测抗体（IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10），充分混匀后室温避光孵育2 h，分别加入1 μL洗液以200 r·min^-1离心5 min后仔细吸取上清液，每管加入300 μL洗液重悬微球，4 h内上机检测。对流式细胞仪进行检测及设置，然后依次采集各标准品和各待测样品，用流式细胞仪和BDCBA 软件获取数据并分析。
1.2.6　病理切片HE染色　造模后第3天、第7天、第14天，各时间点实验组处死2只树鼩，对照组处死1只树鼩，20 g·L^-1戊巴比妥钠注射液（100 mg·kg^-1）深度麻醉后，断头处死。取整个眼球组织甲醛固定、石蜡包埋、切片，行苏木精-伊红（HE）染色，电镜下观察。
1.3　统计学处理　使用SPSS 19.0软件进行数据的统计学分析，计量资料均用均数±标准差（x?±s）表示，两个独立样本采用配对t检验或单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　模型成功率　实验组30只树鼩30眼，观察期满14 d时，26眼出现镰刀菌感染病灶表现，造模成功率为86.7%。
2.2　角膜炎等级评分　26眼造模成功者中，2眼分别于造模后第4天及第5天出现角膜溃疡穿孔，未进行后续房水细胞因子检测，其余24眼角膜炎严重程度基本一致。24眼（92.3%）造模后第3天角膜炎等级评分为1分，第7天角膜炎等级评分为3分，第14天角膜炎等级评分为3分。
2.3　病理切片HE染色　实验组第3天角膜组织见少量炎症细胞浸润，可见分叶状中性粒细胞，近内皮附近可见菌丝及菌丝内间隔（图1A）；第7天时炎症细胞数量急剧增多，以中性粒细胞为主，菌丝附近大量炎症细胞浸润（图1B）；第14天炎症细胞数量稍减少，主要以单核细胞及中性粒细胞为主（图1C）。对照组角膜无水肿，基质层见基质细胞规则排列，未见炎症细胞浸润（图1D）。
2.4　房水中细胞因子
2.4.1　房水中IL-6浓度　造模前两组房水中IL-6浓度差异无统计学意义（P=0.214）；造模后两组间IL-6浓度各时间点差异均有统计学意义（均为P=0.000）；实验组组内不同时间点间差异有统计学意义（P=0.000），对照组组内差异无统计学意义（P=0.402；见表1）。实验组房水中IL-6浓度在造模后第7天达到高峰，对照组在观察期间无明显变化。




2.4.2　房水中IL-1β浓度　造模前两组房水中IL-1β浓度差异无统计学意义（P=0.117）；造模后两组间IL-1β浓度各时间点差异均有统计学意义（均为P=0.000）；实验组组内不同时间点间差异有统计学意义（P=0.000），对照组组内差异无统计学意义（P=0.810；见表2）。实验组房水中IL-1β浓度在造模后第7天达到高峰，对照组在观察期间无明显变化。



2.4.3　房水中IL-4浓度　造模前两组房水中IL-4浓度差异无统计学意义（P=0.078）；两组间IL-4浓度在造模后第7天差异有统计学意义（P=0.006），其余时间点差异均无统计学意义（均为P＞0.05）；实验组组内不同时间点间差异有统计学意义（P=0.032），对照组组内差异无统计学意义（P=0.398；见表3）。实验组房水中IL-4浓度在造模后第7天达到高峰，对照组在观察期间无明显变化。



2.4.4　房水中IL-10浓度　造模前及造模后第3天两组房水中IL-10浓度差异均无统计学意义（均为P＞0.05）；造模后第7天、第14天两组间IL-10浓度差异均有统计学意义（均为P=0.000）；实验组组内不同时间点间差异有统计学意义（P=0.000），对照组组内差异无统计学意义（P=0.469；见表4）。实验组房水中IL-10浓度在造模后第14天达到高峰，对照组在观察期间无明显变化。



3　讨论
    病原微生物入侵机体时，宿主通过模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）对入侵病原体进行识别引起天然免疫应答，活化的PRRs将引发一系列的炎症事件，包括炎症细胞的浸润、吞噬病原体、炎性因子（IL-1β、IL-6、IL-8、γ-干扰素、肿瘤坏死因子-α、IL-4、IL-5、IL-10等）的释放，炎症反应可以清除入侵的病原体。但是，过度的炎症反应将导致局部组织免疫病理性损伤，因此，眼表感染中促炎因子与抑炎因子的动态平衡尤为重要^［8］。了解真菌性角膜炎病程中炎症反应的调节机制对疾病的转归及治疗有重要作用，因此，本实验通过构建树鼩茄病镰刀菌性角膜炎模型，观察不同时间点房水中Th1型细胞因子（IL-1β、IL-6）和Th2型细胞因子（IL-4、IL-10）的表达变化，与相应时间点角膜病理组织切片中中性粒细胞浸润程度对比，了解上述四种炎性因子在茄病镰刀菌性角膜炎炎症反应中的作用。
    角膜组织病理切片HE染色结果与角膜炎等级评分结果显示，实验组造模后第3天角膜组织见少量炎症细胞浸润，主要为中性粒细胞，此时角膜炎病灶为轻度混浊；第7天时中性粒细胞数量急剧增多，菌丝附近见大量炎症细胞浸润，角膜炎病灶表现为浓厚混浊；第14天炎症细胞数量减少，主要以单核细胞及中性粒细胞为主，角膜炎病灶依然为浓厚混浊。观察期内，实验组房水中促炎因子IL-1β和IL-6在造模后第7天浓度最高，与病灶炎症反应最重、病理切片中中性粒细胞聚集最多的时间点吻合。ZHANG等^［9］用酵母菌接种免疫活性的BALB/c鼠、中性粒细胞或CD4T细胞敲除的BALB/c鼠角膜，发现细胞因子IL-6增多；ZHONG等^［10］用曲霉菌及酵母菌接种BALB/c鼠后，发现IL-1β和IL-6基因及蛋白水平在造模后第1天表达最高，给予IL-1β单克隆抗体处理后，炎症反应及角膜损伤明显减轻。以上两个实验与本实验一致的结果是：真菌性角膜炎病程中均可引起IL-1β和IL-6表达的增高。IL-1β主要由炎症细胞及角膜常住细胞分泌，其高表达与炎症细胞浸润数量及角膜炎严重程度呈正相关^［11］。IL-6是一个多功能的细胞因子，可以调控体液及细胞免疫反应^［12］；而且在绿脓杆菌性角膜炎中对中性粒细胞的招募起着重要作用^［13］。本实验发现中性粒细胞浸润最多的时间点与IL-6和IL-1β浓度最高的时间点均为造模后第7天，再次证明中性粒细胞与炎症因子（IL-6和IL-1β）之间存在直接关系。本实验与文献报道不一致的结果：IL-1β和IL-6表达水平最高时间是造模后第1天，较本实验IL-1β和IL-6高表达时间第7天明显前移，可能系不同物种之间存在差异所致，但具体原因还需进一步研究。有研究表明，IL-4是通过激活STAT6途径，依靠转录因子GATA-3以及其他因素（原癌基因c-Maf与生长因子锌指蛋白等）确保CD4细胞向Th2细胞表型分化，并且IL-4可抑制单核巨噬细胞产生IL-1β和肿瘤坏死因子-α^［14］。IL-10是Th1细胞分化的下调者^［15］，由Th2细胞分泌，主要抑制激活的单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和T细胞，还能有效地在mRNA水平抑制单核细胞产生IL-1β、肿瘤坏死因子-α、IL-6和IL-8等促炎症因子和趋化因子^［16］。以上研究与我们的结果一致，本实验中IL-4在造模后第7天浓度最高，IL-10则在第7天明显升高，第14天达到峰值；而IL-1β和IL-6的浓度均在第14天出现降低，说明IL-4和IL-10对IL-1β和IL-6的表达发挥了抑制作用，具体分子机制还需进一步研究。
    本实验不足之处：（1）由于缺乏树鼩商品化的抗体，因此本实验选用抗体的种属特异性是人，结果可能会出现一定偏差；（2） 本实验观察期太短，反映的是急性炎症期，未观察慢性炎症期相关细胞因子的变化。
    综上，Th1型细胞因子（IL-1β、IL-6）和Th2型细胞因子（IL-4、IL-10）在茄病镰刀菌性角膜炎急性炎症期发挥重要作用，研究其分子机制将有助于阐明真菌性角膜炎的发病机制，为临床提供潜在治疗靶点。