《眼科新进展》  2017年9期 819-823   出版日期：2017-09-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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提前光照刺激对早产近视小鼠视网膜中capase-3表达的影响


    近年来围产医学技术发展迅速，使得早产儿的存活率获得较大程度提高，但与足月儿相比，早产儿提早离开母体环境，视觉系统发育还未成熟，加上受低体质量、吸氧等因素影响，出现视觉系统异常或相关眼病的几率明显增高。有研究发现，早产儿与足月儿的屈光发育特点存在明显差异，表现为早产儿正视化过程相对更短^［1］，发生近视的年龄相对更早，发生率也显著高于同龄足月儿^［2-3］，并更易形成屈光不正、屈光参差和斜视、弱视。目前早产儿近视发病机制尚不明确，因早产所致视觉外环境的改变对早产儿近视的影响研究也少见报道。本研究通过提前光照刺激建立早产近视小鼠模型，探究细胞凋亡在早产近视形成中的作用，为早产儿近视的发病机制提供一定的理论基础。
1　材料与方法
1.1　主要试剂和仪器　YZ24带状光检影镜及眼科显微器械均购于苏州六六视觉科技公司，数显电子千分尺（精确度0.001 mm）购于上海三量量具厂，兔抗人caspase-3多克隆抗体、SABC试剂盒、DAB染色剂、TUNEL试剂盒均购于武汉博士德公司。
1.2　动物模型制作及分组　随机选取实验用新生4 d龄C57BL/6L小鼠共60只，雌雄比为2∶1，体质量（2.58±0.24） g，购于武汉大学医学部动物实验中心，饲养环境标准清洁级别，温度18~25 ℃。分别设为P6开睑组、P10开睑组和自然开睑组，每组各20只，P6开睑组小鼠均于新生6 d龄手术分离右侧上、下眼睑使之提前睁眼接受光照，左眼自身对照不作处理；P10开睑组于10 d龄人工开启右侧眼睑，自然开睑组待14 d龄时眼睑自然睁开。所有小鼠均置于室内日光灯照明，光照与黑暗周期12 h∶12 h环境中分笼饲养，于P15进行乙醚麻醉，暗室内检影验光获得双眼屈光度数；摘除全部小鼠的眼球，电子数显千分尺和图像分析法测量眼轴长度，随即去除角膜和玻璃体，用于TUNEL检测、caspase-3免疫组织化学染色和Western-blot，定量检测视网膜中caspase-3的表达。本实验中由于采用新生小鼠，实验起始时共饲养80余只，实验中死亡10只，但仅选取符合本实验条件的60只。
1.3　Caspase-3免疫组织化学染色　将视网膜石蜡切片行二甲苯脱蜡和梯度乙醇水洗，微波抗原修复，体积分数3%H₂O₂室温孵育25 min阻断内源性过氧化物酶，体积分数3%BSA室温封闭30 min。滴加一抗50 μL，湿盒内4 ℃孵育过夜。PBS洗涤5 min×3次，切片稍甩干后滴加与一抗相应种属的二抗（HRP标记）50 μL，室温孵育50 min，PBS洗涤5 min×3次，滴加SABC，室温30 min。PBS洗涤5 min×5次，滴加DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，蒸馏水冲洗切片终止显色。苏木紫复染，脱水封片，显微镜镜检。对阳性细胞率和阳性表达强度予以量化评分，即免疫组织化学评分（IHS）。表达水平=染色强度评分×阳性细胞比评分。具体方法如下：每组随机选取切片3张，在每张切片上随机选3个视野，免疫组织化学染色强度计分：0分判为阴性，1分判为弱阳性，2分判为中度阳性，3分判为强阳性。阳性细胞所占百分比计分：无阳性细胞为0分，阳性细胞占1%~10%为1分，11%~50%为2分，51%~80%为3分，81%~100%为4分。取各组平均数作为该蛋白表达的统计数据。应用HIS评分可代表caspase-3蛋白在视网膜细胞中的表达水平。
1.4　TUNEL检测　将视网膜石蜡切片进行脱蜡处理。室温下将1 g·L^-1 TritonX-100和1 g·L^-1柠檬酸钠溶液滴加于切片的标本区域通透8 min，充分洗涤后室温下静置30 min。按每张切片50 μL的使用量配制TUNEL反应液，滴加于切片后湿盒孵育60 min，阴性对照切片则滴加PBS溶液。滴加体积分数3%甲醇双氧水溶液，避光阻断15 min，PBS溶液充分洗涤后用体积分数20%山羊血清封闭20 min。每张切片滴加适量过氧化氢酶溶液，37℃避光孵育30 min，PBS充分洗涤。滴加新配制的DAB溶液，于显微镜下掌握显色时间，苏木紫复染，脱水封片，显微镜镜检。细胞核棕黄染色者即为阳性细胞。
1.5　Western-blot检测　配制裂解液并研磨视网膜组织，BCA法测定蛋白浓度，每例样品取40 μg总蛋白经SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜上，封闭液室温封闭1 h，除去封闭液后加入稀释的兔抗人caspase-3后4 ℃过夜，洗涤后加入稀释好的HPR-抗兔抗体溶液中室温孵育30 min，经TBST洗涤后在ECL混合液中反应后于暗室曝光显影。以GAPDH蛋白为上样量参照。使用AlphaEaseFC软件处理系统对目标条带的灰度值进行分析。
1.6　统计学方法　本研究统计学处理采用SPSS 19.0统计软件进行分析。计量资料以x?±s表示，配对t检验分析小鼠双眼屈光度数及眼轴长度，组间比较采用方差分析；P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　早期光暴露对小鼠屈光状态的影响　正常小鼠屈光度的变化过程为自远视逐渐向正视或近视发展。P6开睑组于6 d龄接受提前光照，与自身对照左眼相比，诱导形成了相对近视；P10开睑组右眼于10 d龄接受光照，也形成了相对近视；而自然开睑组右眼无相对近视形成；三组间相对近视屈光度比较，差异有统计学意义（P<0.05，见表1）。



2.2　各组小鼠眼轴长度的比较　P6开睑组小鼠右眼的眼轴长度与自身对照左眼比较差异有统计学意义（P<0.05）；P10开睑组小鼠右眼眼轴长度与左眼比较差异有统计学意义（P<0.05）；自然开睑组双眼眼轴长度比较差异无统计学意义（P>0.05，见表2）。



2.3　Caspase-3蛋白免疫组织化学定量分析　免疫组织化学染色观察到P6开睑组、P10开睑组小鼠视网膜中caspase-3蛋白表达明显增强，呈棕黄色，主要表达于视网膜内核层细胞和神经节细胞层，表达部位主要为胞浆，余少量表达于胞核。自然开睑组视网膜caspase-3蛋白表达不明显。caspase-3蛋白在P6开睑组、P10开睑组和自然开睑组视网膜中的表达逐渐降低，HIS评分分别为4.889分、2.889分和0.444分，差异有统计学意义（P<0.05，见图1）。
2.4　TUNEL结果　P6开睑组小鼠右眼视网膜可见较多棕黄色凋亡阳性细胞核，主要表达于神经节细胞层，内核层也可见少量表达。P10开睑组小鼠右眼视网膜神经节细胞层和内核层可见少量凋亡阳性细胞核表达。自然开睑组小鼠右眼仅见神经节细胞层个别阳性细胞核（图2）。
2.5　Western-blot检测结果　Western-blot检测caspase-3蛋白的表达水平，结果显示P6开睑组、P10开睑组及自然开睑组caspase-3/GAPDH灰度值比分别为52.70%、35.76%和22.50%，表达水平呈逐渐下降趋势，差异有显著统计学意义（P<0.01）。而三组左眼视网膜中caspase-3蛋白的表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05，见图3）。





3　讨论
    早产是致使儿童视觉系统发育异常及多种相关眼病发生的高危因素。研究证实，无论有无早产儿视网膜病变的病史，早产儿近视的发生率均明显高于足月儿，且正视化过程也呈提前化趋势^［1-4］。对于早产儿来说，眼球的屈光发育受多种因素影响，除先天遗传因素外，外环境中适宜的视觉刺激也尤为重要。本研究通过控制小鼠提早接受光照的时间，发现提前光照环境对小鼠的屈光度产生影响。
    已有研究显示，C57BL/6J小鼠出生后双眼闭合，视网膜各层结构分化发育尚不成熟，直至14 d龄

自然睁眼时视网膜形态结构及血管发育才基本完善，其视网膜生后发育阶段的特点与人早产儿视网膜发育过程相似^［5-6］。因此我们利用此特点，于小鼠正常睁眼前人工开启眼睑，使小鼠眼球接受提前光照^［7］。本研究中提前接受光照的小鼠均形成了较高的相对近视，不同时期提前光照所致近视的屈光度数也有明显差异，表现为日龄越小、越早睁眼的小鼠形成的相对近视屈光度数越高，P6开睑组小鼠其右眼屈光度为（31.40±0.25）D，与自身对照左眼相比，形成了（-7.55±0.15）D的相对近视。P10开睑组也诱导形成了（-5.25±0.10）D的相对近视。正常日龄下自然睁眼的小鼠双眼屈光度无明显变化，这也与早产儿近视发病的流行病学调查结果相符合，表现为出生体质量越小、胎龄越小的早产儿，近视发病率及程度也越高。本实验结果显示，开睑越早形成的相对近视越高，说明不同时期的视网膜对于光照的敏感性有所差异，由于近视眼的形成过程涉及多种复杂生物信号的调控，我们推测光照其自身属性参数可能作为某种促进或调控因素作用于眼球，影响某些因子的分泌，产生网状分子生物学作用，推动形成了近视的发生。
    90年代XU等^［8］在病理性近视发病机制的研究中，曾提出细胞凋亡可能是发生机制之一。此后研究者在多种实验性近视动物模型眼中均反映近视与视网膜细胞异常凋亡具有密切相关性，以视网膜光感受器细胞、外核层、内核层及神经节细胞层多见凋亡发生^［9-10］，超微结构下表现为不同程度的细胞膜异常收缩破裂、线粒体肿胀、染色质不规则聚集等凋亡特征。细胞凋亡是一种由细胞内基因编码调控的主动自杀过程，在凋亡的执行和效应过程中，caspases介导的级联反应起着关键性作用，当效应caspases被激活后，细胞内的靶物质被快速大量水解，诱导细胞发生不可逆的死亡。其中caspases-3是多种凋亡途径下游中执行死亡程序的关键蛋白酶，又被称作 “杀手蛋白”，不仅反映细胞的凋亡水平，还反映凋亡启动因素的存在^［11］。本研究利用TUNEL技术，在P6开睑组和P10开睑组小鼠右眼中均检测到视网膜细胞的异常凋亡，主要分布在神经节细胞层和内核层，而自然开睑组视网膜凋亡细胞不明显，说明当视网膜提前接受光照刺激，早产小鼠近视眼形成过程中伴随着视网膜的异常细胞凋亡现象。
    本实验通过免疫组织化学染色发现，在P6开睑组和P10开睑组小鼠视网膜组织中caspase-3蛋白表达明显增强，呈棕黄色，主要表达于视网膜内核层细胞和神经节细胞层，免疫组织化学评分值均明显高于自然开睑组，差异有统计学意义。这与TUNEL检测结果中显示的视网膜细胞凋亡位置相吻合。同样，Western-blot检测结果显示，P6开睑组和P10开睑组小鼠视网膜中caspase-3蛋白表达上调，明显高于自然开睑组，表现为小鼠接受提前光照的时间越早，caspase-3的表达量越高。说明caspase-3蛋白在早产近视小鼠模型近视眼视网膜细胞凋亡中扮演重要角色。提前光照刺激小鼠近视形成过程中，视网膜中caspase-3蛋白表达量明显增加，导致神经节细胞层和内核层细胞发生凋亡损伤，凋亡机理可能与caspase-3蛋白表达上调有关。以往在探讨近视发生与细胞凋亡关系的研究中，多以形觉剥夺性近视和离焦性近视研究为主。毛俊峰等^［12］发现在形觉剥夺性近视眼视网膜中caspase-3蛋白的活性增加、表达量上调，内核层和外核层细胞发生明显凋亡，caspase-3蛋白参与凋亡的发生。刘双珍等^［13］进一步向形觉剥夺性近视眼玻璃体内注射caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO，可使鸡缝合眼视网膜细胞的凋亡率下降，caspase-3蛋白的活性和表达也呈下调趋势，并且随着Ac-DEVD-CHO剂量增大，抑制视网膜细胞凋亡的作用也明显增强，表明抑制凋亡“杀手蛋白”caspase-3的表达可有效改善和减少视网膜细胞的凋亡，为实验性近视的研究提供了基础实验依据和治疗的新思路，但对于保护早产儿视网膜细胞是否有效仍待更加深入的研究。
    综上所述，提前光照刺激方法可建立早产近视模型，同时提前开睑小鼠视网膜caspase-3蛋白表达量明显增加，在神经节细胞层和内核层均可观察到细胞的凋亡损伤，提示caspase-3的高表达可能是促进早产近视小鼠视网膜细胞凋亡的原因之一。但是否存在除过早接受光照刺激外的其他因素作用于眼球，调控和推动着屈光向近视发展；同时早期视网膜部分细胞的凋亡是近视形成的伴随因素还是结果尚不十分清楚。今后将针对早产儿近视的具体分子机制进一步深入研究。