《眼科新进展》  2017年9期 816-818   出版日期：2017-09-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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神经生长因子在糖尿病大鼠视网膜突触可塑性中的作用


    糖尿病是一个全球性问题，据估计到2030年糖尿病患者人数将增加至5亿^［1］。糖尿病视网膜病变是20岁及以上糖尿病患者最常见眼部并发症，其主要表现为微血管病变。近年来研究发现，神经病变亦参与糖尿病视网膜病变，其中突触可塑性与视觉信号传递关系密切^［2］。神经生长因子在神经病变领域一直备受关注，与视网膜生长、修复、死亡密切相关^［3］。现已证明神经生长因子可减少视网膜神经元凋亡、促进其生长发育^［4］。此外，神经生长因子还可调节轴突生长和突触活动，但具体机制不清^［5］。本研究通过腹腔注射神经生长因子，探讨神经生长因子对糖尿病大鼠视网膜突触可塑性的影响及机制，期望为糖尿病视网膜病变发病机制的研究提供新的证据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验动物分组及模型制备　取清洁级雄性SD大鼠24只，体质量 200~240 g（购自锦州医科大学实验动物中心）。随机分成对照组、糖尿病组、治疗组，每组8只。后两组大鼠正常饮食3 d后，隔夜禁食水，配制1.5 g·L^-1链脲佐菌素溶液，按55 mg·kg^-1体质量腹腔给药。给药后3 d采尾静脉血检测血糖，将血糖浓度大于16.7 mmol·L^-1的大鼠定为糖尿病大鼠模型。模型诱导成功后，治疗组给予腹腔注射鼠神经生长因子（800 U·kg^-1），每天1次。对照组、糖尿病组给予等剂量生理盐水。12周后，进行各项指标检测，实验遵循国家《实验动物管理条例》。
1.1.2　试剂及仪器　链脲佐菌素（美国Sigma公司），鼠神经生长因子（武汉海特生物制药有限公司），突触素、Caspase-3抗体、β-actin（英国Abcam公司），丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒、荧光二抗及Western blot二抗（北京碧云天生物公司），血糖仪（美国强生公司），荧光倒置显微镜（日本Olympus公司），冰冻切片机（德国SLEE公司），水平电泳仪（美国BIO-RAD公司），超声粉碎机（美国Sonics&Materials公司）。
1.2　方法
1.2.1　视网膜冰冻切片制备　注射12周后，各组取4只大鼠，乌拉坦麻醉大鼠，将灌流管自心尖插入主动脉根部并结扎。立即用磷酸盐缓冲液 300 mL冲洗大鼠血液同时剪开右心耳，待右心耳液体清亮后，换成40 g·L^-1 多聚甲醛固定大鼠，先快后慢，大约持续3 h。待灌注完毕取大鼠眼球置于40 g·L^-1 多聚甲醛中。随后放入300 g·L^-1蔗糖中过夜。OCT包埋，冷冻后进行切片，厚度为12 μm，用于免疫荧光化学染色。
1.2.2　视网膜MDA含量及SOD活性测定　制备视网膜匀浆，5000 r·min^-1离心25 min，留上清；MDA含量检测采用硫代巴比妥酸法，SOD活性检测应用氮蓝四唑光化还原法，均按试剂盒说明书的步骤进行；根据OD值计算视网膜的MDA含量及SOD活性。
1.2.3　免疫荧光技术检测大鼠视网膜突触素表达　磷酸盐缓冲液洗3次，每次10 min；加50 g·L^-1山羊血清置室温1 h；滴加兔抗大鼠突触素，稀释比例为1∶600，4 ℃过夜；磷酸盐缓冲液洗3次，每次10 min；滴加荧光二抗山羊抗兔A594，室温避光2 h；磷酸盐缓冲液洗3次，每次10 min；抗荧光封片剂封片，倒置显微镜观察，利用荧光强度分析视网膜突触素表达。
1.2.4　Western blot检测大鼠视网膜突触素、Caspase-3表达　大鼠乌拉坦深度麻醉后，立即取眼球，解剖镜下分离出视网膜；高效蛋白裂解液裂解视网膜，15 000 r·min^-1 4 ℃离心20 min，留上清；BCA法测定蛋白浓度，电泳时加入15 μL样品；开始电泳，调整电压为90 V，待电泳条带成一条直线时，调整电压为120 V；将目的蛋白转移至PVDF膜上；取目的条带，加1 g·L^-1 牛血清白蛋白室温封闭2 h；加入一抗（兔抗大鼠突触素，1∶10 000；兔抗大鼠Caspase-3，1∶20 000；小鼠抗大鼠β-actin，1∶5 000），4 ℃孵育过夜；TBST洗3次，每次10 min，加入HRP标记的二抗室温2 h，孵育后TBST洗涤3次，每次10 min；ECL试剂盒显影，Image J软件分析灰度值。
1.3　统计学方法　采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行单因素方差分析和LSD检验，所有数值以均数±标准差表示，P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　MDA含量及SOD活性检测结果　MDA含量、SOD活性可间接反映氧化应激程度。3组间MDA含量比较，总体差异有统计学意义（F=85.46，P<0.01，见表1）；糖尿病组MDA含量较对照组明显升高（P<0.01），治疗组较糖尿病组明显降低（P<0.01）。3组间SOD活性比较，总体差异有统计学意义（F=17.76，P<0.01）；糖尿病组SOD活性较对照组明显降低（P<0.01），治疗组较糖尿病组明显升高（P<0.01）。



2.2　免疫荧光技术检测结果　将对照组突触素免疫荧光强度设定为100.00%，荧光强度分析结果显示：3组间突触素免疫荧光强度比较，总体差异有统计学意义（F=395.42，P<0.01）。糖尿病组较对照组荧光强度明显下降（P<0.01），治疗组较糖尿病组荧光强度明显升高（P<0.01，见表2，图1）。




2.3　Western blot 检测结果　3组间突触素相对表达量比较，总体差异有统计学意义（F=17.27，P<0.01）。糖尿病组较对照组突触素表达明显减少（P<0.01），治疗组较糖尿病组明显增多（P<0.01）。Caspase-3蛋白相对表达量3组间比较，总体差异有统计学意义（F=217.13，P<0.01）。糖尿病组Caspase-3表达较对照组明显增多（P<0.01），治疗组较糖尿病组明显减少（P<0.01，见表2，图2）。



3　讨论
    全球糖尿病的日益流行导致了广泛的残疾，降低了预期寿命并造成健康成本巨增。糖尿病视网膜病变是糖尿病的常见并发症，亦为糖尿病患者失明的主要原因。根据世界卫生组织对37万糖尿病失明患者调查数据显示，糖尿病视网膜病变占4.8%^［6］。
    神经生长因子于1948年被发现，可阻止原代培养的神经元凋亡，减少神经退行性疾病动物模型神经元变性^［7］。最近研究发现，神经生长因子可潜在治疗视网膜神经病变，其与视网膜生长、修复、死亡密切相关^［3］。现已证明神经生长因子能减少视网膜神经元凋亡，促进其生长发育^［4］。氧化应激增强与糖尿病视网膜病变发病机制关系密切。氧化应激时体内自由基异常升高，氧化与抗氧化失衡，此时氧化作用突出，最终诱导组织细胞损伤^［8］。MDA是脂质过氧化代谢产物，SOD是自由基清除剂。MDA含量升高，SOD活性下降，提示氧化应激程度增强^［9］。Caspase-3为细胞凋亡标志物，凋亡时表达升高。本研究发现，糖尿病状态下，MDA含量增多，SOD活性降低，Caspase-3表达增强。由此我们推断，视网膜细胞凋亡的原因一方面可能为体内高血糖诱导的多种途径对视网膜细胞造成损伤，另一方面可能是氧化应激增强导致的视网膜细胞凋亡。而应用神经生长因子后，治疗组与糖尿病组相比，MDA含量下降，SOD活性升高，Caspase-3表达降低，提示神经生长因子可通过降低糖尿病视网膜病变及视网膜氧化应激使视网膜细胞免受损伤。
    突触素是一个完整的膜蛋白突触小泡。突触素在突触小泡形成和胞吐作用中提供多种功能，在神经递质传递中起重要作用。它被广泛应用作为突触功能标记之一，也被认为与神经组织发育过程中突触发生和突触可塑性密切相关^［2］。突触素开始表达于大鼠出生后4~12 d，呈点状分布于视网膜内丛状层和外丛状层。突触素表达与突触生长及视觉信号传递关系密切。糖尿病会导致突触早期损伤，突触素数量会急剧下降，但其具体机制有待进一步探讨^［10］。氧化应激是破坏视网膜的主要因素，氧化应激增强会导致神经营养因子的表达下调，包括脑源性神经营养因子和神经生长因子^［11］。此外，神经生长因子还可调节轴突生长和突触活动，但具体机制不清^［5］。本研究发现糖尿病状态下，视网膜突触素表达明显降低，进而说明突触活动已受抑制，因而突触数量明显降低。应用神经生长因子治疗后，氧化应激程度降低，突触素表达上升。这提示神经生长因子可能通过抑制氧化应激提高了视网膜突触数量。
    综上所述，本研究发现神经生长因子可通过降低糖尿病视网膜氧化应激，抑制视网膜细胞凋亡，恢复视网膜突触数量。提示神经生长因子可能通过氧化应激途径参与糖尿病视网膜突触可塑性的变化。这一发现对研究糖尿病视网膜病变的发病机制提供了新的方向。但因糖尿病视网膜病变发病机制复杂，神经生长因子对糖尿病视网膜病变的作用可能涉及众多途径，因此神经生长因子对糖尿病视网膜突触可塑性的影响及机制仍需进一步深入探讨。