《眼科新进展》  2017年9期 810-815   出版日期：2017-09-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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骨髓间充质干细胞（MSCs）对N-甲基-N-亚硝脲（MNU）诱导的C57BL小鼠视网膜变性的治疗作用


    视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）是一系列以进行性感光细胞及色素上皮功能丧失为共同表现的视网膜退行性疾病，能损害视力并最终致盲，严重影响患者的生活质量，已引起人们的广泛关注^［1］。RP病理机制复杂且尚未明确，现有治疗方法均有一定的局限性，未能有效治愈RP^［2］。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有自我更新能力和多向分化潜能而且免疫原性弱。特定小分子可在体外诱导MSCs分化为视网膜感光细胞、神经节细胞或类神经元细胞^［3-6］。近年来，N-甲基-N-亚硝脲（N-methyl-N-nitrosourea，MNU）诱导的RP模型被国内外学者广泛使用^［7-8］。本研究旨在应用MNU诱导的RP动物模型来探索MSCs对该类疾病的治疗作用，从而为视网膜疾病的治疗提供理论基础及实验依据。
1　材料与方法
1.1　材料　SPF级健康成年雄性C57BL小鼠90只，6~8周龄，体质量18~22 g，由西安交通大学医学部实验动物中心提供。MNU购自美国Sigma-Aldrich公司；胎牛血清（FBS）、α-MEM培养基。
1.2　方法
1.2.1　MNU诱导RP动物模型的条件优化
1.2.1.1　不同剂量的MNU对视网膜组织形态和电生理功能的影响　将36只C57BL小鼠随机分为6组，每组6只，具体分组为：对照组、30 mg·kg^-1 MNU组、45 mg·kg^-1 MNU组、60 mg·kg^-1 MNU组、75 mg·kg^-1 MNU组、90 mg·kg^-1 MNU组。每只小鼠进行标记、称体质量并记录，按照体质量及指定剂量注射相应体积的MNU；给药方式为腹腔注射。MNU注射完成后将各组小鼠放置于6个笼子里，正常喂养7 d后，分别进行视网膜电图（electroretinogram，ERG）检测和HE染色。
1.2.1.2　MNU作用不同时间对视网膜组织形态和电生理功能的影响　选择最佳剂量的MNU给药后，观察作用不同时间后视网膜组织的功能及形态学变化。将24只C57BL小鼠随机分为4组，每组6只，具体分组为对照组、D1组、D3组和D7组。MNU给药后，分别在1 d、3 d和7 d时进行ERG检测和HE染色，观察视网膜电生理功能和视网膜组织形态变化。
1.2.2　MSCs的提取、鉴定与筛选　从6只C57BL小鼠的长骨中提取骨髓细胞，种于100 mm的培养皿中，在37 ℃环境培养3 h以促进黏附细胞附着，随后PBS清洗2次去除未黏附细胞。将提取的MSCs用含体积分数10% FBS的α-MEM培养基进行重悬种植；置于37 ℃、含体积分数5%CO₂培养箱中进行培养。MSCs培养12~15 d后形成黏附菌落，应用相关标记分子对其进行鉴定和筛选。MSCs鉴定和筛选：阳性指标有CD29（95.4%）、CD44（91.8%）、CD90（97.8%）、CD105（98.4%）、CD146（57.1%）和Sca-1（60.5%）；阴性指标有CD34（6.5%）、CD14（2.3%）和 CD45（0.5%）。
1.2.3　MSCs移植　本研究采用的MSCs移植方式有以下两种：（1）MSCs-1组：系统性移植，尾静脉注射^［9］MSCs 1 mL，共3×106个细胞；（2）MSCs-2组：眼内局部移植，玻璃体内注射^［10］MSCs 2 μL，共50×103个细胞。以优化的MNU诱导RP小鼠动物模型为研究对象，进行视网膜MSCs移植，观察MSCs对小鼠视网膜损伤的治疗作用。将24只C57BL小鼠随机分为以下4组，每组6只小鼠：（1）空白对照组；（2）MNU单独作用组；（3）MSCs-1组：MNU（D1）+MSCs（尾静脉注射，D7）；（4）MSCs-2组：MNU（D1）+MSCs（玻璃体内注射，D7）。MSCs注射7 d后进行ERG检测和HE染色，观察视网膜电生理功能和视网膜组织形态变化。
1.2.4　ERG检测　ERG检测前需将实验小鼠84只置于暗环境下进行暗适应16~24 h。ERG检测的整个过程亦在暗环境下进行（可使用相对较弱的红光照明）。依次进行小鼠麻醉、散瞳、眼内局部麻醉后，将小鼠置于三脚架平台上，连接相应的视觉电生理仪电极，采用视觉电生理仪专用的软件进行ERG数据采集，阻抗应低于5%，记录视杆反应-视网膜电图（Rod-ERG）和最大反应-视网膜电图（Max-ERG），并保存所得结果，整理数据并进行统计分析。
1.2.5　视网膜HE染色　所有小鼠眼球在体积分数10%中性甲醛中固定24 h；用蒸馏水冲洗附着的固定液，随后依次采用体积分数55%、65%、75%、85%的乙醇溶液进行梯度脱水各45 min；去除眼前节；再依次采用体积分数90%、100%的乙醇溶液进行梯度脱水各20 min；三氯甲烷透明10 min；软蜡浸泡30 min，硬蜡浸泡30 min；包埋制作组织石蜡块。将包埋好的蜡块切成厚4 μm的组织切片，充分烘干后备用。将视网膜组织石蜡切片进行常规HE染色，测量视网膜外核层（outer nuclear layer，ONL）厚度并进行统计分析，来评估视网膜的组织结构形态。
1.3　统计学分析　采用SPSS 16.0统计软件进行实验结果的数据分析；涉及实验均为多组实验，均采用One-way ANOVA的方差分析；以P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　不同剂量的MNU对C57BL小鼠视网膜组织形态和电生理功能的影响　ERG结果显示：与对照组相比，30 mg·kg^-1 MNU给药7 d后可引起ERG波幅轻微降低，只有Max-ERG的a波明显降低（P<0.01），其他ERG波幅均与对照组无明显差异。45 mg·kg^-1 MNU给药7 d后可引起ERG波幅明显降低（ERG各波形均为P<0.001）。与对照组相比，60 mg·kg^-1及其以上剂量（75 mg·kg^-1、90 mg·kg^-1）的MNU给药7 d后，ERG波幅明显降低（ERG各波形均为P<0.001；见图1），视网膜损害十分严重。
    HE结果显示：与对照组相比，30 mg·kg^-1 MNU可引起视网膜形态相对轻微的损伤，视网膜ONL厚度有所变薄，但其细胞排列基本规律整齐；45 mg·kg^-1 MNU可引起视网膜ONL厚度变薄，细胞排列基本规律整齐；而60 mg·kg^-1及其以上剂量（75 mg·kg^-1、90 mg·kg^-1）的MNU可使视网膜ONL厚度明显变薄，组织结构混乱，内外核层融合，损伤严重（图2）。HE结果的统计分析（图3）表明：与对照组相比，30 mg·kg^-1 MNU组的ONL厚度无明显变化（P>0.05）；45 mg·kg^-1 MNU组的ONL厚度开始变薄（P<0.05）；60 mg·kg^-1 MNU组、75 mg·kg^-1 MNU组和90 mg·kg^-1 MNU组的ONL厚度明显变薄（均为P<0.001）。综上结果，60 mg·kg^-1 MNU可引起视网膜电生理功能及形态结构的严重损伤，故后续实验均采用60 mg·kg^-1 MNU作为模型建立的最佳剂量。





2.2　最佳剂量的MNU作用不同时间对C57BL小鼠视网膜组织形态和电生理功能的影响　ERG结果显示：与对照组相比，60 mg·kg^-1 MNU作用后 1 d 和3 d开始，视网膜功能即出现明显降低趋势（D1组：Max-ERG，a波，P<0.01，b波，P<0.05；D3组：ERG各波形均为P<0.001）；60 mg·kg^-1 MNU作用后7 d，ERG波幅明显降低，呈现熄灭型波形，视网膜损害十分严重（D7组：ERG各波形均为P<0.001；见图4）。
    HE结果显示：与对照组相比，60 mg·kg^-1 MNU作用后1 d、3 d，视网膜形态结构开始出现ONL厚度变薄等轻微损伤，作用后7 d，视网膜ONL厚度更薄，内外核层融合，损害严重（图5）。HE结果的统计分析（图6）表明：与对照组相比，D1组和D3组的视网膜ONL厚度呈现一定程度的变薄（D1组，P<0.05；D3组，P<0.001），D7组最为严重（D7组，P<0.001）。
    综上结果，MNU作用1 d开始，视网膜电生理功能及形态结构均开始呈现损伤，到7 d时，视网膜损害最为严重。





2.3　移植MSCs对MNU诱导的C57BL小鼠视网膜变性的治疗作用　ERG结果显示：与对照组相比，60 mg·kg^-1 MNU作用后7 d（MNU单独作用组）ERG检测波幅明显降低，呈现熄灭型波形，视网膜损害严重（与对照组相比，ERG各波形均为P<0.001）；与MNU单独作用组相比，MSCs-1组作用7 d后，小鼠视网膜的ERG波形明显恢复，呈现一定的治疗作用（与MNU单独作用组相比，ERG各波形均为P<0.001）；MSCs-2组作用7 d后，呈现与MSCs-1组类似的治疗作用，即ERG波形的各个波幅均有所恢复（与MNU单独作用组相比，ERG各波形均为P<0.001；见图7）。
    HE结果显示：与对照组相比，MNU单独作用组视网膜形态结构出现厚度变薄、细胞结构混乱、内外核层逐渐融合等损伤；与MNU单独作用组相比，MSCs-1组作用7 d后，呈现一定的治疗作用，即视网膜的ONL厚度均趋于恢复，内外核层间距恢复，视网膜整体厚度亦加厚；MSCs-2组作用7 d后，呈现与MSCs-1组类似的治疗作用（图8）。HE结果的统计分析（图9）表明：与对照组相比，MNU单独作用组视网膜ONL厚度明显变薄（P<0.001）；与MNU单独作用组相比，MSCs-1组和MSCs-2组视网膜ONL厚度均呈现一定程度的增加（均为P<0.001）。





3　讨论
    RP是一组进行性致盲的遗传性视网膜退行性变疾病，共同的发病机制为感光细胞死亡或缺失。感光细胞属于神经细胞，其损伤后不可自我修复及再生，目前尚无能治愈RP的治疗方法^［11］。因此，针对RP的有效治疗方案亟待解决。低剂量的烷化剂MNU经腹腔单次注射可诱导选择性的视网膜感光细胞损伤，如SD大鼠、挪威鼠、兔等，是目前广泛应用的RP动物模型^［7，12］。不同品系动物模型所用MNU剂量略有不同。本研究进一步优化了MNU诱导C57BL小鼠RP模型的条件，结果表明：60 mg·kg^-1 MNU是引起C57BL小鼠视网膜电生理功能及形态结构严重损伤的最佳剂量；60 mg·kg^-1 MNU作用的动态变化趋势是：1 d时视网膜电生理功能及形态结构均开始呈现损伤，到7 d时，视网膜损害最为严重。
    目前针对RP这类疾病，主要是对症治疗及缓解视网膜细胞变性，包括药物治疗、营养支持治疗、神经生长因子的应用等，现有这些治疗方法可在不同程度上阻止病程进展，但缺乏有效促进视网膜细胞再生的方法，尚不能治愈RP^［13］。干细胞具有自我更新能力和多项分化潜能，因此干细胞移植治疗有望成为该类疾病具有潜力的治疗手段和较为热点的研究问题^［14］。MSCs是目前研究相对深入的一群具有多向分化潜能的成体干细胞。近年来研究发现MSCs体外可诱导分化为视网膜感光细胞^{［5-6，15-16］}；将MSCs经视网膜下腔注射给RCS（royal college of surgeons）大鼠，MSCs可与宿主视网膜结构相融合，形成感光细胞层^［16］。这使得应用MSCs移植治疗RP成为可能。目前尚未见关于MSCs对于MNU诱导的RP小鼠模型影响的相关研究。本研究应用MNU诱导C57BL小鼠RP模型，系统性移植（尾静脉注射）和眼内局部移植（玻璃体内注射）MSCs，发现MSCs移植对MNU注射后诱导产生的视网膜形态结构和电生理功能损伤均具有一定的修复作用，两种不同方法移植MSCs后对MNU诱导的视网膜损伤具有一定的治疗作用。在RP早期（MNU刺激后1 d）给予MSCs移植干预，有效阻止了RP的进一步病程发展。
    在碘化钠诱导的视网膜退化大鼠模型中，视网膜下注射MSCs向视网膜感光细胞和色素上皮细胞分化^［17］。视网膜下注射高表达CX3CL1的MSCs对光损伤大鼠模型具有免疫调节作用^［18］。我们推测MSCs移植的治疗作用的发挥可能同时存在两种机制：（1）MSCs向视网膜感光细胞和色素上皮细胞分化，替代损伤细胞修复组织；（2）分泌免疫因子调节局部微环境而阻止进一步视网膜损伤。这些还需要在后续工作中进一步探索。
    综上所述，经尾静脉注射和玻璃体内注射移植MSCs对于MNU诱导的RP小鼠模型具有一定的治疗作用，包括视网膜电生理功能的恢复，内核层和ONL厚度、细胞排列及视网膜组织厚度的恢复。同时，MSCs具有来源丰富、取材方便，避免伦理道德问题等优越性，因而在RP等视网膜退行性变疾病的治疗中具有良好的应用前景。