《眼科新进展》  2017年8期 755-758   出版日期：2017-08-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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原发性先天性青光眼（PCG）患儿与正常婴幼儿血浆中微小核糖核酸（miRNA或miR）-29b、miR-24、miR-200c的表达差异及临床意义


    近年来多学科研究表明，组织及细胞内外微小核糖核酸（miRNA或miR）的表达与病理反应密切相关，在患有眼疾时患者眼部某些miRNA的表达具有组织特异性和发育阶段特异性^［1］，可作为疾病诊断、分型及预后判断的分子标志。青光眼的发生、发展与小梁细胞数目减少、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）堆积阻塞房水引流密切相关^［2］，部分miRNA可下调小梁细胞转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）的表达，减少ECM在小梁网的异常沉积，在一定程度上控制了青光眼疾病的进展。小梁网发育不良是原发性先天性青光眼(primary congenital glaucoma,PCG)最为常见的发病原因。研究发现miR-29、miR-24及miR-200c在人小梁细胞上存在并表达^［3-5］，但关于PCG患者血浆miRNA的表达情况及相关临床意义尚未见报道。本研究通过检测正常人和PCG患儿血浆中miR-29b、miR-24和miR-200c的表达情况，探讨其可否作为临床上辅助诊断PCG的新指标。
1　资料与方法
1.1　一般资料　收集2015年至2017年散发的PCG患儿16例作为PCG组，其中男8例，女8例，双眼发病5例，单眼发病11例，年龄（21.3±2.1）个月；选取年龄相近的正常婴幼儿共49名，其中男25名，女24名，年龄（23.1±1.8）个月作为正常人组。PCG组所有患者血浆标本均采于术前尚未进行任何有关青光眼治疗时。两组受试者抽血当天统一用芬兰Icare（爱科）手持式回弹眼压计在清醒状态下连续测量5次眼压，100 g·L^-1水合氯醛（按0.5~0.8 mL·kg^-1计算）镇静状态下测量角膜横径，复方托吡卡胺滴眼液散瞳（每5 min 1次，共3次）后观察眼底情况并记录。受试者血浆标本留取前均签署知情同意书，并通过医院伦理委员会审核批准。
1.2　方法
1.2.1　血浆留取及RNA提取　采集PCG组和正常人组受试者血浆标本3 mL置于EDTA抗凝管中，2 h内4000 r·min^-1 4 ℃离心10 min，取上清液至无RNA酶的试管中（分装为2份，每管500 μL）,-80 ℃ 温度下保存，待用。采用Trizol-LS（美国Invitrogen公司产品）试剂提取血浆总RNA，取300 μL与1200 μL Trizol-LS充分混匀后，严格按照试剂说明书操作。
1.2.2　miR-29b、miR-24、miR-200c定量检测　以U6为内参，采用Poly A加尾（TAKARA试剂盒）逆转录实时荧光定量PCR法进行检测。逆转录反应体系如下：2×逆转录缓冲液10 μL，0.1 g·mL^-1牛血清蛋白2 μL，miRNAPrimeScript@RT酶混合剂2 μL，总RNA 800 ng，引物1 μL，水补足20 μL，置37 ℃孵育60 min，85 ℃孵育5 min，反应产物为cDNA，置于 -20 ℃ 冰箱保存。PCR反应体系如下：2×缓冲液10 μL，引物1 μL，cDNA 5 μL，水4 μL，置Hema9600 PCR仪上按95 ℃5 min，95 ℃10 s，60 ℃34 s反应45个循环，采集数据分析结果。
1.3　统计学分析　采用SPSS 17.0软件进行数据分析，结果用均数±标准差（x?±s）表示。对PCG组和正常人组miR-29b、miR-24、miR-200c的相对表达量（2^-△△Ct值）分别进行Wilcoxon秩和检验；PCG 组按严重程度分3个亚组，并与正常人组3种miRNA相对表达量进行单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义,应用 Medclac 软件制作 ROC曲线对3种 miRNA的诊断准确性进行评价。
2　结果
2.1　PCG组和正常人组miR-29b、miR-24、miR-200c的表达差异　PCG组受试者血浆中miR-29b、miR-24、miR-200c相对表达量均明显低于正常人组，差异均有统计学意义（均为P＜0.05，见表1）。



2.2　血浆中miR-29b、miR-24、miR-200c相对表达量与PCG病情严重程度的关系　方差分析显示，不同病变程度PCG患者血浆中3种miRNA表达差异均有统计学意义（P＜0.01）；Tamhane法分析可知，miR-29b和miR-24相对表达量与PCG疾病严重程度有关，病情越严重，其表达量越低（均为P＜0.05）；miR-200c相对表达量与PCG疾病严重程度无关（P＞0.05,见表2）。



2.3　受试者ROC曲线　应用Medcalc软件分别对3种miRNA做ROC曲线分析，并对它们曲线下的面积进行比较，结果表明miR-29b及miR-24对于PCG疾病诊断价值优于miR-200c（见图1、表3）。




3　讨论
    有研究表明细胞外miRNA能稳定存在于各种体液、血浆/血清中^［6-11］，可抵抗RNA酶降解，能耐受强酸碱、反复冻融等极端条件。在眼科方面，有报道发现人小梁细胞、房水、玻璃体中均存在miRNA，不同眼病miRNA的表达种类及含量存在差异。DUNMIRE等^［12］在白内障患者房水中检测到110种miRNA，但未能取得正常人房水，无法分析白内障患者房水中miRNA含量与正常人差异。对于先天性青光眼患儿早期诊断或疑似病例来讲，无论小梁细胞或房水取材都相当困难，因此采用外周血浆检测miRNA较为方便可行,其实际意义可能更大。
    本研究发现miR-29b、miR-24和miR-200c均稳定存在于正常人及PCG患者血浆中，其中PCG患者血浆中miR-29b呈明显低表达状态，且PCG疾病严重程度越高，血浆中miR-29b的含量越低。多个研究表明，miR-29b对小梁细胞胶原蛋白和ECM关键物质的表达起负调节作用^{［3,13-14］}，miR-29b序列与胶原蛋白Ⅰa1和a2 3’端非翻译区互补配对结合，使相应mRNA降解、失稳定或抑制其蛋白翻译过程^［15］。因此，当miR-29b呈低表达时可能会使小梁网ECM合成增多，甚至过度堆积，使房水外流阻力增加，眼压升高进而参与青光眼形成与发展。ZANON-MORENO等^［16］在原发性开角型青光眼相关研究中发现miR-29b可能还通过作用于其他途径提高人小梁细胞的活性或功能；在小梁组织、房水及Schlemm管壁提取的脂质经过氧化作用后初级和次级产物的堆积与该病的发生存在相关性。
    miR-24簇包括miR-23b、miR-24和miR-27b，编码基因都位于9q22染色体上，在不同疾病状态下可呈现不同的表达水平^［17］。miR-24可通过各种不同通路与TGF-β相互作用，影响胶原代谢过程，减少ECM合成，抑制纤维化进程。实验证实miR-24在小梁细胞上表达，可靶向调节青光眼相关基因——人源转化蛋白FURIN表达水平及相关产物,最终调控胶原代谢过程^［18-19］。相关实验发现过表达的miR-24可使活化的TGF-β1表达下调30%，同时两者在相互调控上存在反馈关系，TGF-β1可上调miR-24的表达^［4］。此外，有学者发现乳腺癌患者miR-27b的低表达可能促使细胞色素CYP1B1蛋白表达上调^［20］。CYP1B1蛋白通过雌二醇参与眼部发育，雌二醇可抑制TGF-β1过度产生，减少胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ等ECM合成；也可通过视黄酸信号转导通路影响眼前段发育，全反式视黄酸可抑制胶原蛋白Ⅰ启动子活性，减少胶原蛋白Ⅰ合成及其生物活性^［21-24］。因此，我们推测在miR-24、TGF-β1及CYP1B1之间可能存在共同调节通路，miR-24低表达可使TGF-β1表达上调，ECM过多堆积。本研究结果显示PCG组血浆中miR-24相对表达较正常人组显著降低。RAGUSA等^［25］研究发现黄斑裂孔、视网膜脱离及葡萄膜黑色素瘤患者玻璃体液与健康人血清中miR-24的表达差异为5%。结合本研究结果，血浆中miR-24表达水平与PCG疾病严重程度呈负相关，提示miR-24可能是PCG一个敏感指标，但本研究尚未明确血浆CYP1B1蛋白、TGF-β1蛋白表达水平是否与miR-24表达水平直接相关，这仍需进一步研究。
    小梁细胞收缩可以通过减少细胞间隙大小来降低小梁细胞渗透率和房水流出，因此，抑制小梁细胞肌动蛋白系统可有效增加房水排出和降低眼压。miR-200家族监管着小梁细胞的肌动蛋白系统^［26］。LUNA等^［5］通过动物实验证实miR-200c能够抑制锌指增强子结合蛋白，起到调控小梁细胞肌动蛋白系统的作用。眼内注射miR-200c能明显降低眼压，说明miR-200c通过调节小梁细胞的形态参与到房水外流及眼压调节过程中。本研究结果显示正常婴幼儿血浆中miR-200c相对表达量是PCG患儿的2.95倍，但统计结果显示血浆中miR-200c的含量与PCG疾病严重程度无关，可能存在以下原因：(1)PCG组病例较少，不足以显示出PCG患儿病情严重程度与血浆中miR-200c含量的差异性；(2)由于未对每例PCG患儿基因进行逐一筛查，可能存在某些相关基因的缺失或突变；(3)miR-200c可能为PCG发病机制的上游或初始因素，仅与疾病的发生有关，与疾病的严重程度无关。
    综上所述，3 种无特定组织特异性的细胞外 miRNA不仅稳定存在于血浆中，且在PCG患者中呈低表达（与正常人组比较），其中 miR-29b、miR-24 表达水平与病情严重程度相关，此外 ROC 曲线相关分析证实 miR-24与miR-29b对本病诊断较为敏感、准确，有望成为新的分子生物学指标来辅助诊断PCG。