《眼科新进展》
2017年8期
728-731
出版日期：
2017-08-05
ISSN:
1003-5141
CN:
41-1105/R
miR-34a/SIRT1在H
2
O
2
诱导人晶状体上皮细胞氧化应激中的表达
白内障的发生、发展与晶状体上皮细胞氧化损伤密切相关
［1］
。氧化损伤是导致晶状体上皮细胞发生凋亡的重要因素之一。有研究表明，晶状体上皮细胞凋亡是除先天性白内障以外所有类型白内障的共同细胞学基础
［2］
。miR-34a编码基因位于1p36.2上，在多种肿瘤组织和细胞中呈低水平表达。过表达miR-34a可促进多种肿瘤细胞发生凋亡
［3-5］
。近来有研究
［6］
发现微小RNA-34a（microRNA-34a，miR-34a）和沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)表达水平变化与白内障发生密切相关，然而其具体机制仍不明确。本研究采用不同浓度的H
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O
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处理人晶状体上皮细胞（human lens epithelial cell，HLEC)，模拟晶状体氧化损伤过程，通过检测miR-34a/SIRT1基因表达情况，揭示miR-34a/SIRT1与氧化损伤引起的晶状体上皮细胞凋亡的关系。
1 材料与方法
1.1 材料 HLEC株SRA01/04（上海博谷生物科技有限公司）；枸杞多糖（北京大学医学部药学院中药研究所）；CCK-8（上海贝博生物有限公司）；H
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(美国Sigma公司）；Annexin V-FITC/PI流式细胞检测试剂盒(南京凯基生物科技公司）；Trizol 试剂（美国Invitrogen 公司）；cDNA 合成试剂盒和SYBR Green RT-PCR 试剂盒（日本Toyobo公司）。
1.2 方法
1.2.1 HLEC的培养及分组 将HLEC株SRA01/04置于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液中，在37 ℃、体积分数5% CO
2
孵育箱中培育。每2 d换液一次，待细胞融合达到90%左右时，用胰蛋白酶消化传代。用不同浓度的H
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（0 μmol·L
-1
、100 μmol·L
-1
、200 μmol·L
-1
、300 μmol·L
-1
、400 μmol·L
-1
）处理细胞24 h后，用CCK-8检测细胞存活率，倒置显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞凋亡率和RT-PCR检测miR-34a/SIRT1的表达。然后将细胞分为8组：NC+100 μmol·L
-1
H
2
O
2
组、miR-34a mimics+100 μmol·L
-1
H
2
O
2
组、NC inhibitor+100 μmol·L
-1
H
2
O
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组、miR-34a inhibitor+100 μmol·L
-1
H
2
O
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组、NC+200 μmol·L
-1
H
2
O
2
组、miR-34a mimics+200 μmol·L
-1
H
2
O
2
组、NC inhibitor+200 μmol·L
-1
H
2
O
2
组和miR-34a inhibitor+200 μmol·L
-1
H
2
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2
组，再用CCK-8检测各组细胞存活率。
1.2.2 CCK-8检测细胞存活率 按照CCK-8试剂盒说明操作如下：将SRA01/04细胞以每孔0.2×106个接种于96孔板中。根据分组情况处理细胞后，每孔加入10 μL CCK-8溶液混匀，继续培养2 h。用酶联免疫仪测定450 μm波长处吸光度（A）值，来计算细胞的存活率。
1.2.3 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡率检测 将SRA01/04细胞以每孔0.2×106个接种于96孔板中。根据分组情况处理细胞后，用EP管收集各组细胞。加入10 μL Annexin V-FITC和10 μL PI孵育20 min。用PBS洗两次，加入缓冲液重悬，用流式细胞仪检测并分析结果。
1.2.4 脂质体介导的RNAi转染SRA01/04细胞 按照Lipofectamine
?
RNAiMAX转染试剂的说明书进行脂质体介导的RNAi转染。将复苏后的第3代SRA01/04细胞接种到6孔培养板中培养24 h后进行转染。分别将miR-34a mimics、miR-34a inhibitor、NC inhibitor及control和5 μL Lipofectamine
?
RNAiMAX及250 μL Opti-MEM
?
轻柔混匀，常温孵育20 min，将混合物加入6孔板中，混匀。培养6 h后换液，24 h后荧光显微镜观察细胞转染情况并计算转染效率，并进一步用流式细胞仪检测转染效率。
1.2.5 RT-PCR检测miR-34a/SIRT1 mRNA表达 收集各组细胞样品，按照试剂盒说明书提取总RNA。MiR-34a的引物序列：F：5’-ATGGTTCGTGGGTGGCAGTGTCTTAGCTGG-3’，R：5’-GCAGGGT-CCGAGGTATTC-3’；SIRT 1的引物序列：F：5’-GGAGGAGCTGGATTTGGGACTGAT-3’，R：5’-GGTGGAACAATTCCTGTACCTGCACA-3’，扩增长度143 bp；内参引物序列U6：F：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，R：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，扩增长度94 bp。95 ℃ 5 s，59 ℃ 30 s；45个循环。溶解曲线：温度61~95 ℃，每分钟读1次。反应结束后，记录PCR仪上的扩增曲线显示的Ct值，利用公式2
-△△Ct
=［△△Ct=(Ct
实验组目的基因
-Ct
实验组内参
)/Ct
对照组目的基因
-Ct
对照组内参
)］ 分析 mRNA的相对表达量。
1.3 统计学处理 用SPSS 16.0统计软件处理数据，数据采用均数±标准差表示。组间计数资料的比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 H
2
O
2
对SRA01/04细胞存活率的影响 SRA01/04细胞存活率随着H
2
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2
浓度增加而降低（图1），呈剂量依赖性；100 μmol·L
-1
H
2
O
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组、200 μmol·L
-1
H
2
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组、300 μmol·L
-1
H
2
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组、400 μmol·L
-1
H
2
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组细胞存活率分别为80%、50%、30%、10%；各处理组与0 μmol·L
-1
H
2
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2
组相比差异均有统计学意义（均为P＜0.01)。
2.2 H
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2
对SRA01/04细胞形态和细胞凋亡的影响 如图2所示，0 μmol·L
-1
H
2
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2
组SRA01/04细胞呈多边形、星形和不规则形（图2A）；100 μmol·L
-1
H
2
O
2
组SRA01/04细胞皱缩稍变圆，边界稍模糊；200 μmol·L
-1
H
2
O
2
组SRA01/04细胞皱缩变圆，边界明显模糊，细胞密度下降；300 μmol·L
-1
H
2
O
2
组SRA01/04细胞出现显著碎裂，细胞密度进一步明显下降。细胞凋亡检测结果显示（图2B、2C）：随着H
2
O
2
浓度的增加，SRA01/04细胞凋亡率明显增加，0 μmol·L
-1
H
2
O
2
组、100 μmol·L
-1
H
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O
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组、200 μmol·L
-1
H
2
O
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组、300 μmol·L
-1
H
2
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组细胞凋亡率分别为（6.1±1.2)%、(26.3±1.8)%、(32.5±2.2) %、(64.7±5.3)%，三组分别与对照组（0 μmol·L
-1
H
2
O
2
组）相比较，差异均有统计学意义(均为P＜0.01)。
2.3 H
2
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2
对SRA01/04细胞miR-34a/SIRT1表达的影响 随着H
2
O
2
浓度的增加，SRA01/04细胞中的miR-34a表达水平呈剂量依赖性上调（图3A），100 μmol·L
-1
H
2
O
2
组、200 μmol·L
-1
H
2
O
2
组和300 μmol·L
-1
H
2
O
2
组与0 μmol·L
-1
H
2
O
2
组分别比较，差异均有统计学意义（t=-8.854，P=0.001；t=-15.27，P=0.000；t=-10.08，P=0.001），而SIRT1表达水平相应下降（图3B），100 μmol·L
-1
H
2
O
2
组、200 μmol·L
-1
H
2
O
2
组和300 μmol·L
-1
H
2
O
2
组与0 μmol·L
-1
H
2
O
2
组分别比较，差异均有统计学意义（t=11.23，P=0.000；t=16.63，P＜0.000；t=22.05，P＜0.000）。
2.4 miR-34a对H
2
O
2
处理的SRA01/04细胞存活率的影响 miR-34a mimics+100 μmol·L
-1
H
2
O
2
组比NC+100 μmol·L
-1
H
2
O
2
组细胞存活率明显降低，差异有统计学意义（t=6.591，P=0.000、图4）；miR-34a mimics+200 μmol·L
-1
H
2
O
2
组比NC+200 μmol·L
-1
H
2
O
2
组细胞存活率明显降低，差异有统计学意义（t=8.800，P＜0.000）；miR-34a inhibitor+100 μmol·L
-1
H
2
O
2
组比NC inhibitor+100 μmol·L
-1
H
2
O
2
组细胞存活率明显提高，差异有统计学意义（t=-5.906，P=0.000）；miR-34a inhibitor+200 μmol·L
-1
H
2
O
2
组比NC inhibitor+200 μmol·L
-1
H
2
O
2
组细胞存活率明显提高，差异有统计学意义（t=-4.674，P=0.002）。
3 讨论
为了探究不同浓度H
2
O
2
对SRA01/04细胞存活率的影响，我们选取0、100、200和300 μmol·L
-1
四种H
2
O
2
浓度，与SRA01/04细胞共培养24 h后，CCK-8检测细胞的存活率。结果发现，SRA01/04细胞存活率随H
2
O
2
浓度增加而降低，呈剂量依赖性；200 μmol·L
-1
H
2
O
2
对SRA01/04细胞存活抑制率约为50%。我们进一步通过倒置显微镜观察，发现随着H
2
O
2
浓度的增加，SRA01/04细胞之间连接减少，大量细胞发生皱缩变圆，边界非常模糊，细胞密度下降，说明H
2
O
2
可破坏细胞间的连接，从而破坏了晶状体上皮细胞间紧密连接，使其屏障作用破坏，以致晶状体纤维发生混浊，发生白内障。
近来有研究
［7］
发现miR-34a表达水平上调和白内障发生密切相关，但miR-34a在白内障发生中的作用及机制仍不十分明确。为了进一步探究miR-34a在白内障发生中的具体分子机制，我们采用 H
2
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诱导SRA01/04细胞氧化应激损伤，观察在氧化应激损伤中miR-34a表达情况，结果发现miR-34a表达水平与氧化应激损伤程度呈正相关，随着 H
2
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2
浓度增加，细胞凋亡增加，miR-34a表达水平明显上调。同样有大量研究发现miR-34a在多种肿瘤细胞中表达下调，上调肿瘤细胞中miR-34a表达可促进细胞凋亡
［8-9］
。此外，miR-34a下调对心肌细胞、血管内皮细胞
［10］
、肝细胞
［11］
等具有保护作用，减少其氧化应激损伤。说明miR-34a可参与细胞凋亡过程。为了进一步阐明miR-34a在晶状体上皮细胞氧化应激损伤中的作用，我们将miR-34a mimics 和miR-34a inhibitor转染到SRA01/04细胞中，观察miR-34a上调和下调对H
2
O
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诱导晶状体上皮细胞氧化应激损伤的影响。结果发现上调miR-34a可明显增加SRA01/04细胞的氧化应激损伤；而下调miR-34a可增加SRA01/04细胞抗氧化应激损伤。
SIRT1是miR-34a作用的靶基因之一，在细胞氧化应激过程中发挥重要的作用，可保护细胞，减轻细胞凋亡。PENG等
［12］
发现 SIRT1在大鼠和人高龄眼组织中表达水平明显下降，与视网膜干细胞自我更新能力密切相关，其推测 SIRT1蛋白对视网膜和视神经具有保护作用，其可减少神经细胞凋亡，保护视神经。随着年龄增长，视网膜遭受紫外线、氧化应激等外界不良因素刺激，从而引起眼底视网膜外层的光感受器遭受氧化应激的损伤。SIRT1蛋白在视网膜光感受器外节广泛分布，其可以对光感受器起着重要的保护作用。敲除SIRT1基因的成年小鼠，其视网膜各细胞层比正常小鼠视网膜各层薄，同时伴有结构异常。说明 SIRT1具有重要的抗氧化应激的能力，而SIRT1表达水平下降与白内障发生相关，我们前期研究也发现SIRT1蛋白表达水平降低与大鼠白内障发生相关。那么SIRT1在晶状体上皮细胞氧化应激损伤中是否起着一定作用，我们通过RT-PCR检测不同浓度 H
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诱导晶状体上皮细胞氧化应激损伤，结果发现随着氧化应激损伤加重，SIRT1表达水平明显降低；且与miR-34a表达水平呈负相关，说明miR-34a可能通过靶向调控SIRT1表达，参与氧化应激损伤。TABUCHI等
［13］
比较冠心病和非冠心病患者内皮祖细胞中miR-34a和SIRT1的表达情况，结果发现冠心病患者内皮祖细胞 miR-34a表达水平明显上调，同时伴SIRT1表达的下调；阿托伐他汀治疗后可下调miR-34a的表达和促进SIRT1的表达。XIONG等
［14］
研究表明，随着年龄增长，小鼠耳蜗毛细胞 miR-34a上调，抑制 SIRT1蛋白的表达，促进 p53乙酰化和 p53激活，促进细胞凋亡，从而引起年龄性听力下降。以上研究同样说明，miRNA-34a靶向调控SIRT1蛋白在细胞凋亡过程中起着重要的作用。
综上所述，SRA01/04细胞氧化应激损伤可引起miR-34a表达水平上调，同时伴随SIRT1表达水平下调；上调miR-34a可促进SRA01/04细胞氧化应激损伤，而下调miR-34a则可减轻氧化应激损伤。本研究仍存在一定不足，对miR-34a是否通过SIRT1通路参与SRA01/04细胞氧化应激，需进一步通过双荧光报告基因确认。