《眼科新进展》  2017年8期 714-718   出版日期：2017-08-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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间充质干细胞对兔自身免疫性干眼模型病理改变及细胞因子表达的影响


    目前，干眼发病率呈逐年上升趋势。人工泪液替代疗法，可暂时缓解眼表症状,但具有抗炎作用的药物如激素和免疫抑制剂长期使用会产生较大的副作用，因此寻找安全有效的干眼治疗方法一直是眼科临床亟待解决的问题^［1-2］。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能成体干细胞，其免疫调控作用是近年来干细胞研究领域的一项重要突破。自体和异体来源的MSCs具有相似的免疫抑制功能^［3］，这种免疫抑制功能还可以跨越物种限制^［4］。值得关注的是，来自自体免疫性疾病患者自身的MSCs与正常人MSCs相比，在表型、体外扩增、诱导分化、免疫抑制以及Toll样受体表达等方面无显著差异。这些特性使得异体MSCs移植以及患者自体MSCs移植均成为可供选择的治疗途径，MSCs全面的独特免疫调节能力使其在临床治疗干燥综合征及其相关靶器官损害中具有广泛的应用前景。本研究建立自身免疫性兔模型，并静脉输注MSCs，观察MSCs对兔自身免疫性干眼组织病理学及泪腺中细胞因子的影响，探讨MSCs在自身免疫性干眼中的作用机制。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验动物及分组　取健康成年雌性新西兰白兔24只24眼，体质量2600~3500 g（北京维通利华实验动物技术有限公司提供）。实验前通过裂隙灯检查排除眼前节疾病，采用随机数学表法将兔分为正常对照组、干眼模型组和MSCs治疗组，每组各8只8眼，建立兔自身免疫性干眼模型，实验遵循国家实验动物管理保护条例。
1.1.2　试剂与仪器　眼科手术器械 （苏州医疗器械厂），眼科显微镜（日本Olympus公司），7900 HT Fast实时荧光定量PCR仪（爱普拜斯应用生物系统贸易上海有限公司)，淋巴细胞分离液（美国GE公司），SYBRGreen 2×Master Mix、Trizol 试剂盒和逆转录试剂盒(美国Thermo公司)，酶标仪(瑞士TECAN公司)。
1.2　方法
1.2.1　兔自身免疫性干眼模型制备　兔自身免疫性干眼模型建立前1 d用5 g·L^-1妥布霉素眼液滴眼预防感染，每天4次，实验前通过裂隙灯检查排除眼前节疾病。按照0.02 mL·kg^-1体质量标准肌肉注射100 g·L^-1氯胺酮进行麻醉,剪去兔左眼睫毛，将生理盐水和碘伏按4∶1稀释，充分清洗术眼结膜囊，再用生理盐水清洗，结膜囊内滴10 g·L^-1丁卡因滴眼液滴术眼，在超净工作台用无菌手术器械摘取兔左下泪腺，行兔泪腺上皮细胞分离、纯化、培养，分离兔外周血淋巴细胞，将泪腺细胞与外周血淋巴细胞混合培养5 d，观察发现淋巴细胞较之前体积变大，呈圆形，聚集性分布，周围可见围绕的泪腺上皮细胞，用1 mL枪头缓慢吹起落在底部的淋巴细胞，收集到50 mL离心管中，在显微镜下观察,避免吹起贴壁的泪腺上皮细胞，用磷酸盐缓冲液将24孔板洗2遍，2000 r·min^-1离心10 min，弃掉上清，再用磷酸盐缓冲液洗1遍，之后加1 mL的磷酸盐缓冲液计数，吹散细胞，尽可能不要有细胞团块,避免栓塞发生，最后每只兔按照淋巴细胞200×103的数量，每只兔1 mL转移到50 mL离心管中放在冰上保持淋巴细胞活性。釆用静脉输液器，预先将磷酸盐缓冲液充满整个静脉回输装置排空空气预防空气栓塞。通过耳缘静脉回输自体激活的外周血淋巴细胞（2×106个·mL^-1，1 mL）建立干眼模型,用2 mL的注射器推注1 mL 磷酸盐缓冲液确保液体进入静脉血管中，然后在接头处换成有细胞液的注射器，注射前保证无细胞沉淀以防栓塞，匀速推完注射器内液体，最后换成装有磷酸盐缓冲液的注射器，再输入1 mL磷酸盐缓冲液保证细胞完全进入到血管中，以防细胞丢失。
1.2.2　各组处理情况　MSCs治疗组在兔干眼模型造模后的 1~5 d每天自耳缘静脉下注入1 mL的10×106 MSCs；干眼模型组在相同的时间点自耳缘静脉连续输注等体积的磷酸盐缓冲液；正常对照组静脉回输等体积的生理盐水。
1.2.3　组织病理学观察　MSCs治疗6周后，注射戊巴比妥钠（56 mg·kg^-1）同期处死各组兔，分离上下泪腺、结膜置于甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，HE染色后观察浸润细胞的情况。
1.2.4　实时荧光定量PCR检测　参照ZHU等^［5］的方法，应用7900 HT Fast实时荧光定量PCR仪检测泪腺组织中Th1、Th17细胞分化相关细胞因子mRNA相对表达量。用Trizol分别提取总mRNA，按照逆转录试剂盒说明合成cDNA,以cDNA为模板按照实时荧光定量PCR试剂盒的说明书进行PCR扩增。GAPDH基因为内在参照。相对定量结果分析采用比较荧光强度达阈值时的循环数(Ct)值法，即改变的倍数=2^-ΔΔCt，ΔΔCt=（Ct_靶基因-Ct_内参照）_实验组-（Ct_靶基因-Ct_内参照）_对照组。各指标均重复检测3次，取平均值。上下游引物序列如下：GAPDH：上游:5’-GGGTGGTGGACCTCATGGT-3’，下游:5’-CGGTGGTTTGAGGGCTCTTA-3’；IFN-γ：上游:5’-CTCTGCCTCATCTTGGGTTCTT-3’，下游:5’-GGTGTTCTGTTTCTCTGGTTAGTGTGT-3’；IL-10：上游:5’-GGCTGAGGCTGCGACAAT-3’，下游:5’-TGCCTTGCTCTTGTTTTCACA-3’；TGF-β：上游:5’-CAAGGACCTGGGCTGGAA-3’，下游:5’-AGGCAGAAGTTGGCGTGGTA-3’；IL-6：上游:5’-GCAGAAAAACCAGTGGCTGAA-3’，下游:5’-GGCCGCGCAGGATGA-3’；IL-17:上游:5’-GGAATGAGGACCACCACATGA-3’，下游:5’-CTGCGTAGGACCAGGATCTCTT-3’。
1.2.5　流式细胞仪检测调节性T细胞的变化　流式细胞仪检测干眼模型组和MSCs治疗组兔泪腺组织和脾脏组织中调节性T细胞（CD4+Foxp3+细胞）占淋巴细胞的比例。
1.3　统计学处理　采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行统计分析。数据以均数±标准差（x?±s）表示，细胞因子数据采用单因素方差分析，偏态分布数据比较采用秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　组织病理学观察
2.1.1　泪腺组织HE染色结果　MSCs治疗6周后，取各组兔泪腺并行HE染色显示：正常对照组未见或仅见少量淋巴细胞浸润（图1A）；干眼模型组兔泪腺内有些腺泡细胞表现为粉色改变和轻度皱缩，提示泪腺内部分腺体细胞开始出现萎缩,腺管周围和小血管周围可见散在分布的淋巴细胞汇集区（图1B）；与干眼模型组相比，MSCs治疗组泪腺内淋巴细胞浸润减轻，腺泡细胞形态较好（图1C）。



2.1.2　结膜组织HE染色结果　正常对照组结膜组织中无明显淋巴细胞浸润(图2A)；干眼模型组结膜组织中可见大量的淋巴细胞浸润聚集，细胞出现变性，部分细胞出现萎缩，结膜杯状细胞减少，结膜上皮结构破坏不完整，可见鳞状上皮化生(图2B)。相比之下，MSCs治疗组结膜组织中淋巴细胞浸润聚集显著减轻，上皮结构完整，变性和萎缩细胞较少见(图2C)。
2.2　实时荧光定量PCR检测结果　实时荧光定量PCR检测泪腺组织中Th1和Th17细胞分化相关细胞因子IFN -γ、IL-17以及转录因子T-bet和RORrt mRNA表达水平；MSCs治疗组泪腺组织中Th1特征性细胞因子IFN-γ以及转录因子T-bet mRNA表达水平较干眼模型组明显下降，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。Th17细胞分化相关细胞因子IL-17表达水平有下降趋势，但两组差异无统计学意义(P>0.05);其转录因子RORrt mRNA的表达水平较干眼模型组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。
    实时荧光定量PCR检测细胞因子mRNA表达的结果显示：MSCs治疗组泪腺组织中炎症因子TNF-α表达较干眼模型组显著降低，而抑炎因子TGF-β的表达较干眼模型组显著升高，差异均有统计学意义（均为P<0.05，表2）。





2.3　调节性T细胞的变化　泪腺组织中干眼模型组调节性T细胞（CD4+Foxp3+细胞）占淋巴细胞的比例为10.0%，而MSCs治疗组中调节性T细胞占淋巴细胞的比例为27.8%，MSCs治疗组调节性T细胞较干眼模型组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。脾脏组织中干眼模型组调节性T细胞占淋巴细胞比例为2.1%，而MSCs治疗组中的调节性T细胞占淋巴细胞的比例为3.9%，脾脏组织中MSCs治疗组调节性T细胞较干眼模型组亦显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。
3　讨论
    干眼是指由于泪液的质和（或）量或流体动力学异常引起的泪膜不稳定和（或）眼表损害，导致眼部不适症状及视力障碍的一类疾病^［6］。干眼的发病机制较为复杂，涉及年龄、性激素水平、细胞凋亡、炎症、自身抗体、病毒感染及自身免疫等多方面因素^［7-8］。干眼是眼科临床常见的自身免疫性疾病之一，应用激素及免疫抑制剂治疗有明显的副作用，如何更有效安全地治疗干眼是目前的研究热点之一。
    MSCs是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期中胚层和外胚层，广泛存在于结缔组织和器官间质中，易于诱导分化和分离培养，具有黏附性、免疫调节特性和一定迁移能力，无伦理学限制^［9］。本实验采用BASSI等^［10］的方法，分离出的MSCs呈长梭形紧密平行或旋涡状排列，体外可诱导成脂肪细胞、成骨细胞，呈现了人脐带来源的MSCs的生物学特征。
    本实验通过耳缘静脉成功将MSCs注入到兔体内，观察MSCs对兔自身免疫性干眼的组织病理学影响。经MSCs治疗后，泪腺和结膜组织中淋巴细胞浸润明显减少。泪腺组织炎症因子IFN-γ及转录因子T-bet和RORrt mRNA的表达水平MSCs治疗组较干眼模型组降低，而抑炎因子IL-10、TGF-β的表达较干眼模型组升高，调节性T细胞数显著升高。
    近年来实时荧光定量PCR检测发现Th17细胞参与宿主的免疫防御反应，是干眼等自身免疫性疾病发病的主要细胞^［11］。在干眼发病过程中Th17细胞过度活化、功能亢进，诱导相关炎症因子、趋化因子产生，破坏角膜上皮，参与泪腺组织炎症细胞浸润和组织破坏，导致炎症反应发生^［12］。PFLUGFELDER等^［13］研究报道TGF-β和IL-6协同作用于原始的CD4+T细胞，启动CD4+T细胞表达RORrt，RORrt作为Th17细胞分化过程中关键性的转录因子，调控IL-17 mRNA的表达，参与Th17细胞分化的调控过程和细胞因子IL-17的分泌，RORrt缺失会阻止CD4+T细胞向Th17细胞分化。本实验结果显示MSCs能抑制泪腺组织中RORrt和T-bet的表达。T-bet是Th1细胞特异性的转录因子，T-bet的表达水平与Th1细胞分化相关细胞因子的表达水平呈正相关^［14］。T-bet还可以下调Th2细胞分化相关细胞因子IL-4的表达，诱导Th2细胞向Th1细胞分化，也有研究报道T-bet直接抑制Th2细胞转录因子GATA-3的表达及作用^［15］。本研究结果同MOHAMMADAZADEH等^［16］报道相一致，MSCs能够抑制CD4+T细胞向辅助性T细胞谱系分化，并能减轻疾病的进展。泪腺组织中Th1/Th17细胞分化除受转录因子调节外，还受多种细胞因子的调节，TGF-β和IL-6共同参与到Th17细胞分化，低浓度的TGF-β能协同IL-6诱导初始的CD4+T细胞向Th17细胞的方向分化和增殖，而高浓度的TGF-β则抑制Th17细胞分化，IL-6能抑制TGF-β促进Th17细胞的分化和IL-17等细胞因子表达水平的上调^［17-19］，造成了促进Th17细胞分化的微环境。REN等^［20］研究报道MSCs治疗组TGF-β的表达水平显著升高，这与本研究结果一致。
    综上所述，MSCs能恢复部分泪腺组织的分泌功能，减轻泪腺组织、结膜等眼表组织淋巴细胞浸润。MSCs抑制T淋巴细胞活化增殖，抑制T细胞向Th1、Th17细胞方向分化，下调Th1、Th17效应细胞功能，抑制炎症因子分泌的同时促进抑炎因子分泌，进而发挥免疫调节作用。目前对MSCs的免疫调控机制尚不十分明确，其对自身免疫性干眼的具体调控机制尚有待进一步研究。