《眼科新进展》  2017年8期 709-713   出版日期：2017-08-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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羊膜泪道支架预防去势雄兔干眼症的实验研究


    干眼症又称角结膜干燥症，其泪膜稳定性下降主要因泪液的异常所引起，从而导致患者眼部不适、或出现眼表组织损害等症状，严重时甚至可能造成角结膜病变。干眼症病理过程复杂，发病机制尚未明确，其病因主要包括性激素水平下降、眼表上皮病变和炎症反应等。目前干眼症的治疗主要以缓解症状为主要目标，其方法包括人工泪液滴眼、性激素治疗、抗炎与免疫抑制治疗等^［1］，而手术治疗适应证少，且只能部分解决泪液分泌问题，而长期使用槲寄生、鬼针草等中药制剂虽有一定的疗效，但无法确定患者对其的依从性，使用范围还不是十分广泛^［2-3］，因此寻找新的预防干眼症的方法是十分必要的。羊膜泪道支架是以羊膜为主要材料的新型理想的泪道支撑材料，相比于目前常用的泪道支架，其抗原性低，组织相容性较好，具有一定的生物学功能，给患者的异物刺激感较弱，具有保留残留泪液、治疗泪道阻塞等作用。本研究将羊膜泪道支架植入于去势雄兔的泪小管，并在造模前后进行对比，探究羊膜泪道支架在预防干眼症中的应用效果，为以后预防干眼症的发生提供一定的实验依据。
1　材料与方法
1.1　实验材料　羊膜泪道修复支架（江西瑞济生物工程有限公司），SchirmerⅠ试纸(博士伦公司)，聚氯乙烯塑料薄膜、滤纸(上海半岛实业有限公司)。
1.2　动物分组及手术　在相对恒温的无菌环境饲养雄性新西兰白兔(实验动物由南昌大学医学院动物实验部提供)至1.5个月龄。对新西兰白兔行裂隙灯显微镜、眼底镜检查，排除眼前节及眼底无异常，选取36只健康、体质量1.8~2.0 kg、泪液分泌试验(Schirmer Ⅰ test，S Ⅰ t)≥10 mm/5 min的新西兰白兔。将36只所选实验兔剪除第三眼睑，在予3 g·L^-1氧氟沙星眼液滴眼1周的情况下适应性喂养1周。参照马轶群等^［4］的方法，将36只新西兰大白兔行双侧睾丸切除术后随机分为A、B、C三组(各12眼，均为右眼)：A组手术后1个月不进行任何处理；B组手术当天将羊膜泪道支架植入泪道5 s后取出观察1个月；C组手术当天植入羊膜泪道支架1个月。分别于植入前及植入后2周、4周、6周行S Ⅰ t、角膜荧光素(fluorescent，FL)染色、角膜共焦显微镜扫描、泪道组织K16、α-SMA免疫荧光及Western Blot检查。本研究实验符合动物伦理委员会的要求^［5］。
1.3　S Ⅰ t检查及FL染色方法　S Ⅰ t是取有刻度的试纸（5 mm×35 mm），将一端反折轻轻置于被测眼下结膜囊的中外1/3处，其余部分悬空垂直于皮肤表面，记录5 min后取出滤纸上泪痕的长度。参照文献^［6］的标准，以≥10 mm/5 min为正常。每组动物均由同一人检查，每组动物每次检查时间、地点、温度、湿度及照明亮度相同。FL染色检测：对实验兔予1滴10 g·L^-1荧光素钠滴眼，待其瞬目，评分系统参考文献^［7］标准分为4级，0级：没有染色；1级：播散性污渍染色极少；2级：一定程度的污渍染色，其程度在1~3级间；3级：污渍染色出现明显的融合。
1.4　角膜共聚焦显微镜检查　采用共聚焦显微镜检查实验兔角膜上皮的改变情况，操作步骤参考文献^［8］：使用5 g·L^-1爱尔卡因滴眼液滴眼麻醉眼表面，固定兔头在显微镜前，确保其双眼平视正前方，向前缓慢推进镜头，对中央角膜进行全层扫描，选择其中清晰的、可进行分析的图像进行保存，对角膜上皮基底细胞及炎症细胞密度使用分析软件进行计算。
1.5　免疫荧光染色　参照文献^［9］方法：（1）取出兔泪小管冰冻组织切片，复温后在常温下晾干；（2）丙酮溶液固定并PBS漂洗3次，每次10 min；（3）Triton X-100固定20 min；（4）牛血清白蛋白(BSA)封闭：常温1 h；（5）4 ℃孵育，滴加BSA 稀释的一抗(K16：1∶150；α-SMA：1∶150)，过夜；（6）PBS漂洗3次，每次10 min；（7）避光，37 ℃温度下滴加第二抗体作用1 h；（8）避光，PBS漂洗3次，每次10 min，封片；（9）观察、对比结果，拍照，并用IPP软件进行半定量。
1.6　Western Blot检查　选择80 g·L^-1 SDS-PAGE胶电泳对煮过的3组泪道黏膜蛋白质组织样品进行电泳分离，通入55 mA电流电泳约2 h直至标记物溴酚蓝到达凝胶底部；浸润：PVDF膜在甲醇溶液中浸润；电转：稳流电转 30～60 min；孵育：移去电泳胶，将PVDF膜置于2.5 g·L^-1明胶封闭液中，在室温环境下缓慢摇晃持续30 min 或 在4 ℃封闭液内封闭过夜，加入一抗溶液（K16，浓度为1∶150）进行孵育准备，室温环境下孵育 1～2 h或 4 ℃孵育过夜；冲洗：用TBST冲洗3次，加入与浓度为1∶150的K16一抗溶液相对应的带辣根过氧化物酶的二抗溶液（浓度为1∶150），在室温环境下孵育1～2 h或 4 ℃条件下孵育过夜，TBST漂洗3次，增强型化学发光剂浸润自显影观察有无条带。
1.7　统计学方法　采用Graph Pad Prism 4.00统计软件进行统计学处理，以均数±标准差（x?±s）表示计量资料，计数资料用χ2检验，检验水准均为α=0.05；各组治疗前后及两组间同一时间点的均数比较采用单向方差分析student-t检验及Dunnett-test检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　植入羊膜泪道支架前后各组间S Ⅰ t评定结果比较　采用重复测量数据的方差分析，结果显示：不同时间点间的泪液分泌量有明显改变（F=7.126，P=0.009）；三组间泪液分泌量有明显改变（F=12.582，P=0.005）；三组的泪液分泌量变化趋势也有明显改变（F=8.531，P=0.007；见表1）。



2.2　植入羊膜泪道支架前后各组间FL染色评分结果比较　采用重复测量数据的方差分析，结果显示：不同时间点间的FL染色差异有统计学意义（F=9.658，P=0.016）；三组间FL染色差异有统计学意义（F=13.187，P=0.013）；三组的FL染色结果变化趋势也有明显差别（F=10.652，P=0.019；见表2）。
2.3　羊膜泪道支架植入前后各组间角膜共焦显微镜下观察结果　角膜共焦显微镜下显示：A组有数量较多且不均匀的上皮基底细胞；B组有少量散在分布的光亮的炎症细胞，部分上皮细胞膨胀、变形；C组中角膜上皮基底细胞密度有一定程度的下降，但仅有极少数的炎症细胞浸润（图1）。A组植入后6周上皮基底细胞和炎症细胞密度分别为（3811±414）个细胞和（266±28）个细胞，B组植入后6周上皮基底细胞和炎症细胞密度分别为（3820±314）个细胞和（266±29）个细胞，C组植入后上皮基底细胞和炎症细胞密度分别为（2789±353）个细胞和（67±13）个细胞；A、B、C组上皮基底细胞（F=13.442，P=0.012）和炎症细胞密度（F=9.231，P=0.021）比较，差异均有统计学意义。






2.4　羊膜泪道支架在兔干眼症中应用效果　对三组泪道组织进行取样，均未发现泪道发生黏连。在40倍放大倍数下，3组植入后6周比较，泪道上皮K16染色均为阴性，即泪道上皮K16表达无明显变化，泪道上皮未出现明显地增生等情况（图2）。在20倍放大倍数下，植入后各时间点 A、B、C 三组兔泪小管组织中均可见 α-SMA 表达无明显改变，即兔泪小管的基质层中未见明显的绿色荧光颗粒出现在细胞核周围（图3）。将其进行蛋白质电泳发现各组α-SMA 表达基本一致，差异有统计学意义（F=14.681，P= 0.002；见图3），证明泪道并没有出现纤维化及血管化改变。
3　讨论
    干眼症多根据患者的临床表现、S Ⅰ t及FL染色评分等检查综合考虑进行诊断，而目前对于干眼的预防和治疗也需针对患者干眼症的类型、患者的经济状况、病情的严重程度等多方面因素进行综合考虑，疏通泪小管阻塞主要方法有局部用药、泪道冲洗、泪道探通及泪道激光成形联合泪道置管等，但由于操作时均有可能导致新的创面形成，引起成纤维细胞的增生，纤维组织增多而形成瘢痕，重新将泪小管腔闭塞导致复发^［10-11］。为降低复发率，使用具有物理支撑作用的材料是较好的选择。但目前的支撑材料多坚韧，给患者带来的异物感较为强烈，对眼内组织可能有一定的损伤，导致患者对其接受程度低。因此，开发一种新型的、异物感较小且副作用较小的易于被患者所接受的支撑材料是很好的选择。
    羊膜是一种质地相对柔软的透明组织，自20世纪以来在外科各领域的应用越来越广泛，因其含有大量生物活性成分，可以营养角膜神经，具有促进上皮愈合、减轻炎症反应、促进组织修复和预防瘢痕形成等作用^{［5,12-13］}，在眼科的应用逐渐开展，现已研究开发出多种羊膜制品，广泛用于治疗各类眼表疾达变病^［14-16］。近年来泪道支架开始用于治疗泪小管阻塞，但将其用于预防干眼症仍未有明显进展，其主要原因在于泪道支架质地多坚韧，虽具有较好的支撑作用，可暂时延缓泪液的流失，但因其给患者造成的异物刺激感较强烈，生物相容性较差，一段时间后可能对眼部组织造成损伤，引起炎症，不具有生物学功能，患者难以长期坚持治疗。而作为羊膜制品的羊膜泪道支架可以很大程度上改善目前泪道支架所造成的不良反应。此外，羊膜泪道支架符合泪道生理解剖结构，对于曲折的泪道结构具有较好的适应作用，同时利用支架本身具有的支撑作用，阻塞泪小管以保留残留的泪液，避免免疫蛋白及离子成分的流失，保护眼部组织，增加泪膜稳定性，预防或延缓干眼症的发生。相较于目前预防干眼症的手段，植入羊膜泪道支架的方式更为简便省时、安全无毒，因其材料本身的特性，生物相容性好，对泪小管造成的损伤小，所产生的并发症少，减少了患者多次使用药物治疗所带来的不便及药物引起的各种不良反应，也避免了手术治疗干眼症可能存在的风险。
    本研究结果可以表明，植入羊膜泪道支架后，S Ⅰ t及FL的指标均有不同程度的改变，B组其S Ⅰ t及FL的指标明显有恶化趋势，而C组S Ⅰ t及FL的指标则有了好转。且共焦显微镜检查结果表明，A组有数量较多且不均匀的上皮基底细胞；B组有少量散在分布的光亮的炎症细胞，部分上皮细胞膨胀、变形；C组中角膜上皮基底细胞密度有一定程度的下降，但仅有极少数的炎症细胞浸润，由此可见，造模后B组明显呈现恶化趋势，而C组则有很大程度的改善。这与永久性泪道栓子^［17-18］、Smart Plug 泪小管栓子^［19］、Odyssey硅胶泪点栓子^［20］治疗干眼的临床疗效所取得的结果相类似，均在植入栓子一段时间后对患者干眼症状如干涩、异物感等有明显的缓解，且S Ⅰ t、FL等指标有所好转。但是，相较于前述的几种栓子，本实验的羊膜泪道支架由于其材料本身的特性，给患者带来的不良反应更为轻微，更容易被接受。因此，羊膜泪道支架的使用对于干眼症的发生有一定的预防作用，能在一定程度上改善干眼症所引起的相关指标改变，减少炎症的发生。其可能的机制是由于本实验将羊膜泪道支架作为泪道栓子将其植入泪道，利用泪道栓塞的方式，减少了泪液的流失，增加眼表泪液的含量，利用自然泪液中天然的生长因子、免疫球蛋白等成分，修复眼表的创伤，加强眼表的防御能力，提高泪膜的稳定性，相较于目前激素替代疗法和人工泪液，一定程度上减少了其副作用的产生，这与前述的几种泪道栓子所产生治疗效果的机理相类似。同时，对泪道进行较长时间的阻塞，可减少泪液的排除量，储留泪液，一定程度上改善患者的干眼症状，使眼球表面的泪液含量有所增加，一定程度上可调节眼表微结构，延长药物作用时间，避免频繁用药。
    对于免疫荧光染色所得结果，其表达均为阴性。α-SMA作为肌成纤维细胞的标记物，不仅用来分析组织的纤维化程度，还与眼科有着密切联系。在角膜结膜受到损伤瘢痕形成过程中，损伤后局部发生一系列反应，其中肌成纤维细胞的激活及α-SMA表达量的升高是导致瘢痕形成的中心环节；α-SMA的表达在青光眼术后滤过泡瘢痕化的过程中具有促进作用。
    综上所述，植入羊膜泪道支架具有预防干眼症的作用，同时，借助羊膜本身具有的特性及支架的作用，带给干眼症患者的不良反应较小，具有广阔临床应用前景，进一步进行临床试验并研究其干预机制，探讨其作用的调节机制和有关在临床方面的应用。