《眼科新进展》  2017年7期 619-622   出版日期：2017-07-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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miR-26a对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及机制研究


    葡萄膜黑色素瘤是发生于成人眼最常见的一种原发性恶性肿瘤，在各种原发性眼部肿瘤中，葡萄膜黑色素瘤发病率居于第二位，仅次于视网膜母细胞瘤^［1］。葡萄膜黑色素瘤经手术摘除眼球后，仍有50%患者在接下来的15 a内死于该病，预后较差^［2］。进一步探讨葡萄膜黑色素瘤的发病机制对提高该病的诊治水平具有重要的意义。miRNA是一种非编码单链小RNA，长度一般在22 nt左右，其在多种肿瘤包括葡萄膜黑色素瘤的发病、侵袭转移及抗凋亡过程中都发挥着重要作用^［3］。miR-26a是miRNA家族成员之一，最先在Hela细胞中被发现，miR-26包括miR-26a-1、miR-26a-2和miR-26b三种亚型，分别位于3号、12号和2号染色体上^［4］。目前，尚未见相关文献报道miR-26a与葡萄膜黑色素瘤之间的关系。本文首次在体外研究了miR-26a对葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖、迁移和凋亡的影响，对探索葡萄膜黑色素瘤的发病机制及提高临床治疗与改善预后都具有重要意义。
1　材料与方法
1.1　材料　葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5、M23及正常葡萄膜上皮细胞系ARPE-19购自武汉大学医学实验中心。转染序列miR-26a mimics及对照序列scramble均由上海吉玛生物科技有限公司合成。RPMI-1640培养基购自美国BD公司，Matrigel基质胶（BD Biosciences，San Jose，CA），果蝇zeste基因增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）、GAPDH一抗购自美国Cell signaling公司，羊抗兔二抗购自美国Invitrogen公司。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养、转染及分组　将葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5及M23加入RPMI-1640培养基，于37 ℃、含体积分数5% CO₂培养箱中培养。采用Lipofectamine 2000将细胞系SP6.5分别转染miR-26a mimics及scramble，并以此将其分成miR-26a模拟物组（转染miR-26a mimics）和NC组（转染scramble），转染后继续培养24 h行后续实验。
1.2.2　RNA提取与RT-PCR　(1)miR-26a的测定：按照Invitrogen公司的Trizol reagent说明书，从SP6.5、M23及正常葡萄膜上皮细胞系ARPE-19培养的细胞中提取总RNA，取各组总RNA 1 μg，按cDNA反转录试剂盒反转录为cDNA。在ABI 7500实时荧光定量PCR仪中进行反应，反应条件：94 ℃10 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，共40个循环，以U6小核RNA为内参，使用2^-ΔΔCt方法定量，计算miR-26a的相对表达量。(2)EZH2 mRNA的测定：提取细胞总RNA，逆转录为cDNA，在ABI7500实时定量PCR仪中，逆转录合成EZH2，反应条件：94 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,68 ℃ 2 min，共40个循环，以GAPDH作为内参，正向序列：5’-CCGCTCGAGATTGAGGGGAAAAAGTCACTTCTCC-3’，反向序列：5’-CGGGATCCAGGCTTCCAATGGATCAGTGGT-3’，计算EZH2 mRNA的相对表达量。
1.2.3　细胞增殖能力测定　采用CCK-8法，将miR-26a模拟物组和NC组细胞消化成单细胞悬液，在96孔板上以每孔2000个细胞接种，以200 μL为每孔体积标准。经培养0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h后，每孔加入20 μL CCK-8溶液，在450 nm波长下，采用酶标仪测定各孔吸光度值（OD），每次实验重复3次，绘制细胞增殖曲线。
1.2.4　细胞凋亡能力测定　采用流式细胞术，用Annexin V/PI染色检测，将miR-26a模拟物组和NC组细胞消化成单细胞悬液后，PBS清洗2次，并使用Binding Buffer重悬，加入相应比例的Annexin V抗体，避光染色10 min后加入适量PBS溶液以及PI染料，流式细胞仪检测Annexin V阳性细胞比例来确定细胞凋亡的变化。
1.2.5　细胞迁移能力测定　用细胞划痕实验测定细胞迁移能力，将miR-26a模拟物组和NC组细胞培养于6孔板，待细胞生长至80%融合后，用20 μL灭菌枪头用力划直线。在200×视野下用显微镜查看划痕后0 h和48 h miR-26a模拟物组和NC组细胞修复情况，应用WimScratch在线图像分析系统计算细胞划痕面积。划痕愈合率的计算公式：划痕愈合率=（划痕后即刻的划痕面积-划痕后48 h的划痕面积）/划痕后即刻的划痕面积×100%。实验重复3次，取平均值。划痕愈合率与细胞迁移能力成正比。
1.2.6　细胞侵袭能力测定　用Transwell细胞侵袭实验测定miR-26a模拟物组和NC组细胞侵袭能力。将miR-26a模拟物组和NC组各取20×10³个细胞，接种于Transwell小室的碳酸磷脂表面，将Matrigel基质胶包被于BioCoat TM上室，在37 ℃条件下培养24 h后将上层小室取出，与10 g·L^-1多聚甲醛与膜下面的细胞混合，经2 g·L^-1结晶紫溶液染色15 min后200×视野下计算膜下的细胞数，计算随机状态下10个视野的细胞数平均值。实验重复3次，取平均值。
1.2.7　EZH2蛋白表达的测定　用Western blot法测定EZH2表达量，将miR-26a模拟物组和NC组细胞用RIPA细胞裂解液冰上裂解30 min后，变性、上样，上样量以每孔30 μg总蛋白为准，浓缩胶80 V电泳40 min，分离胶100 V电泳2 h，湿法转膜，加入EZH2、GAPDH一抗，浓度为1∶100，37 ℃孵育4 h，二抗（1∶400）孵育过夜，ECL液显影，灰度值的分析采用Quantity One 1-D软件。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值，实验重复3次，取平均值。
1.3　统计学分析　采用SPSS 20.0统计软件行统计学分析，计量资料用x?±s表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　miR-26a在葡萄膜黑色素瘤细胞系及正常葡萄膜上皮细胞系中的表达　葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5中miR-26a相对表达量为0.250±0.029，细胞系M23中miR-26a的相对表达量为0.350±0.017；正常葡萄膜上皮细胞系ARPE-19中miR-26a相对表达量为1.0；miR-26a在葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5及M23中的相对表达量均低于正常葡萄膜上皮细胞系ARPE-19中的相对表达量（t=-44.790，P<0.001；t=-66.225，P<0.001）。
2.2　过表达miR-26抑制葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5细胞增殖并促进凋亡的作用　转染后，miR-26a模拟物组中miR-26a的相对表达量为10.20±0.45，NC组为1.0，miR-26a模拟物组中miR-26a相对表达量高于NC组（t=35.41，P<0.001），提示转染成功。
    培养0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，miR-26a模拟物组与NC组OD₄₅₀值分别为：0.17±0.02、0.16±0.03（t=0.480，P=0.656），0.28±0.02、0.27±0.03（t=0.480，P=0.656），0.65±0.08、0.76±0.07（t=-1.792，P=0.147），0.69±0.09、1.39±0.11（t=-3.613,P=0.031），1.23±0.15、2.35±0.25（t=-4.250,P=0.009）及2.12±0.23、3.53±0.27（t=-8.530，P=0.001）。流式细胞术检测凋亡率结果显示，miR-26a模拟物组细胞凋亡率为（15.60±2.30）%，NC组为（5.00±0.70）%，miR-26a模拟物组细胞凋亡率高于NC组（t=7.636，P=0.001）。
2.3　过表达miR-26a抑制葡膜黑色素瘤细胞系SP6.5细胞迁移和侵袭的能力　转染24 h后，miR-26a模拟物组划痕愈合率为（23.7±2.1）%，NC组为（68.9±5.1）%，miR-26a模拟物组划痕愈合率低于NC组（t=-14.194，P=0.000；图1）。miR-26a模拟物组侵袭细胞数为（45.1±3.9）个，NC组为（115.3±8.9）个，miR-26a模拟物组侵袭细胞数低于NC组（t=-12.513，P=0.000；图2）。



2.4　miR-26a过表达抑制EZH2的表达　RT-PCR结果显示，miR-26a模拟物组EZH2 mRNA相对表达量为0.32±0.06，NC组为1.0，miR-26a模拟物组低于NC组（t=-19.629，P<0.001；图3A）。miR-26a模拟物组EZH2蛋白相对表达量为0.39±0.09，NC组为1.0，miR-26a模拟物组EZH2蛋白相对表达量低于NC组（t=-11.739，P=0.000；图3B）。




3　讨论
    葡萄膜黑色素瘤85%起源于葡萄膜，包括睫状体、脉络膜和虹膜^［5］。影响其预后的因素包括发病部位、巩膜外侵袭、肿瘤体积、上皮细胞型还是梭状细胞型、3号染色体缺失、8q染色体的异常扩增等^［6］。目前主要治疗手段是行眼球摘除术、质子照射和放射敷贴治疗，但这些手段仅对原发性葡萄膜黑色素瘤有明显作用，对转移性葡萄膜黑色素瘤患者疗效不佳。而超过半数的原发性葡萄膜黑色素瘤会发生转移，转移部位包括肝脏、肺、骨和皮肤^［7］。许多研究表明，miRNA在肿瘤的发生及发展过程中扮演着重要的角色。
     至今已经有大量miRNA被发现，其广泛参与了生物机体的生长、分化和发育的各个阶段，在许多疾病中发挥着重要的作用^［8-9］。葡萄膜黑色素瘤的相关研究表明，从大豆中分离的genistein可以调控miR-271及其靶基因ZBTB10来抑制葡萄膜黑色素瘤的生长^［10-11］。miR-9的表达与肿瘤的侵袭和转移密切相关^［12］，在高侵袭性的葡萄膜黑色素瘤细胞中，miR-9可以在genistein的诱导下表达上调^［11］。在另外一项研究中发现，miR-34能够抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的生长和迁移，该miRNA被认为与p53抑癌网络有密切关系^［13］。随后的研究发现，miR-34a能够通过抑制体外培养的葡萄膜黑色素瘤细胞的细胞周期来降低其增殖速率，并增加癌细胞对阿霉素的敏感性，但是不直接诱导癌细胞的凋亡^［14］。在葡萄膜黑色素瘤中，有几种miRNA被认为有类似原癌基因的功能，包括miR-20a、miRNA-146a和miRNA-454，这些miRNA在不同程度和阶段促进葡萄膜黑色素瘤细胞的恶性增殖和发展^［15］。但是，有些miRNA起着相反的抑癌作用，例如miR-144和miR124a^［16］。
    在不同肿瘤类型中，miR-26a既有促进癌症发生的功能，也有抑制肿瘤发生的功能。有研究发现，miR-26a能够抑制乳腺癌、肝癌和鼻咽癌细胞的增殖^［17-19］。在前列腺癌中，miR-26a表达异常下调，过表达miR-26a能够抑制癌细胞增殖并诱导其凋亡^［20］。与之相反，在胶质瘤中，miR-26a却能促进肿瘤细胞的增殖^［21］。在非小细胞肺癌细胞中，miR-26a能通过作用于PTPN13降低癌细胞对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性^［22］。miR-26a的异常表达与甲状腺癌、肺癌和乳腺癌有关^{［17，22-23］}。本研究发现，相较于正常葡萄膜上皮细胞，miR-26a的表达在葡萄膜黑色素瘤细胞系中低表达，而通过过表达miR-26a，葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5细胞的增殖、迁移和侵袭都受到了显著的抑制，而葡萄膜黑色素瘤细胞凋亡水平明显升高，说明miR-26a可抑制葡萄膜黑色素瘤细胞增殖，并诱导凋亡，发挥着抑癌基因的作用。
    但是miR-26a的作用机制还不明确，通过对其下游靶基因进行分析，发现EZH2的mRNA和蛋白表达下调。EZH2编码一个746个氨基酸的蛋白质，其同源物首先发现于果蝇中，其在X染色体失活、造血细胞发育分化和肿瘤发生过程中有重要作用^［24］。PcG和TrxG两个基因是防止细胞改变、维持细胞形态的重要成分，EZH2是其中的一种重要的PcG蛋白，对基因表达调控和生长控制有重要作用^［25］。在前列腺癌中，发现从正常细胞向恶性癌细胞转化过程中，EZH2被活化并有异常高表达^［26］。以上结果与本研究结果一致，说明miR-26a可能是通过调节EZH2的表达来影响下游细胞增殖、转移和凋亡通路的。
    综上所述，本研究发现miR-26a在葡萄膜黑色素瘤细胞中表达下调，其原因可能是通过作用于EZH2基因来调控葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖、迁移与凋亡的。miR-26a起抑癌基因的作用，并有望成为葡萄膜黑色素瘤诊断的潜在生物靶标。