《眼科新进展》  2017年6期 501-505   出版日期：2017-06-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
多重酪氨酸激酶受体抑制剂decorin对高糖低氧条件下血-视网膜内屏障的保护作用及机制研究


    视网膜病变是主要的致盲性眼病。血-视网膜屏障破坏所致的视网膜血管渗漏及随后发生的黄斑水肿是其致盲的主要原因之一［1］。血-视网膜屏障分为血-视网膜内屏障及血-视网膜外屏障，前者主要由视网膜毛细血管内皮细胞组成，后者主要由视网膜色素上皮细胞组成，两者共同调控视网膜内液体平衡。视网膜病变早期即可出现血-视网膜屏障的破坏，因此及时进行干预对延缓视网膜病变的发生发展将产生积极影响。核心蛋白多糖（decorin）作为多重酪氨酸激酶受体抑制剂，其抗新生血管作用已得到广泛研究。研究表明，高糖低氧条件下单层视网膜色素上皮细胞的屏障功能被破坏，而decorin能够明显改善该现象［2］，由此可见decorin对血-视网膜外屏障发挥重要的保护作用，但decorin是否同样对高糖低氧条件下的血-视网膜内屏障具有保护作用仍有待研究。本实验通过培养人脐静脉内皮细胞，验证decorin对高糖低氧条件下血-视网膜内屏障的保护作用，同时检测decorin对p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）表达水平的影响，探讨其可能的潜在调控机制。
1　材料与方法
1.1　试剂及仪器　重组人decorin（美国R&D公司）；DMEM培养液、胎牛血清、青链霉素、胰蛋白酶、磷酸缓冲液、异硫氰酸荧光素标记的右旋糖酐（fluorescein isothiocyanate，FITC-dextran）（美国 Hyclone公司）；细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）；ELISA试剂盒（美国 Sigma公司）；抗claudin-5、occludin抗体（美国Santa Cruz Biotechnology 公司，稀释比例1∶100）；抗ZO-1抗体（美国Invitrogen公司，稀释比例1∶100）；抗p38 MAPK及p-p38 MAPK抗体（美国 CST公司，稀释比例1∶1000）；二抗（武汉博士德公司）。Millicell电阻仪、Transwell（美国Millipore公司）；电泳仪及转印槽（美国 Bio-Rad公司）；二氧化碳培养箱、超净工作台、全自动酶标仪（美国Thermo公司）。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养　人脐静脉内皮细胞购自美国 ATCC，配制完全培养液：向DMEM培养基中加入体积分数10%胎牛血清及10 g·L-1青链霉素，将人脐静脉内皮细胞接种至75 cm2的培养瓶中，加入完全培养液后置入37 ℃、体积分数5% CO2的细胞培养箱中过夜。待细胞生长融合达瓶底面积的80%以上时进行消化、传代及冻存等操作。
1.2.2　CCK-8检测decorin对人脐静脉内皮细胞存活率的影响　将人脐静脉内皮细胞按照每孔10×103个接种至96孔板中过夜使其贴壁生长，饥饿12 h后，将培养液更换成分别含有0 nmol·L-1、10 nmol·L-1、50 nmol·L-1、100 nmol·L-1、200 nmol·L-1的decorin培养液继续培养24 h后，采用倒置显微镜观察各组细胞形态学改变，随后向培养基中加入10 μL 2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠溶液。37 ℃继续孵育4 h，酶标仪450 nm处检测各孔吸光度。将各组存活细胞数与0 nmol·L-1decorin组存活细胞数的比值作为观察指标进行统计。
1.2.3　ELISA检测decorin抑制血管内皮生长因子分泌的有效浓度　将人脐静脉内皮细胞按照每孔400×103个接种至6孔板中过夜，饥饿12 h后，将细胞分为6组：（1）正常对照组：仅使用 5.5 mmol·L-1右旋葡萄糖进行刺激；（2）0 nmol·L-1decorin组、10 nmol·L-1 decorin组、50 nmol·L-1 decorin组、100 nmol·L-1 decorin组、200 nmol·L-1 decorin组，分别使用相应浓度的decorin孵育，除正常对照组外，其他组经不同浓度decorin孵育1 h后，将培养液更换为含25 mmol·L-1右旋葡萄糖培养液并加入100 μmol·L-1 CoCl2进行低氧刺激［3］。分别在刺激6 h、12 h、24 h、48 h后收集上清，采用ELISA检测各时间点不同浓度decorin处理后血管内皮生长因子水平。通过与0 nmol·L-1 decorin组比较，结合CCK-8的结果，选择100 nmol·L-1 decorin作为干预条件，进行后续实验。
1.2.4　跨内皮细胞电阻的监测　将细胞分为正常对照组（5.5 mmol·L-1右旋葡萄糖）、高糖低氧组（25 mmol·L-1右旋葡萄糖+100 μmol·L-1 CoCl2）、甘露醇对照组（5.5 mmol·L-1右旋葡萄糖+19.5 mmol·L-1甘露醇）及decorin组（25 mmol·L-1右旋葡萄糖+100 μmol·L-1 CoCl2+100 nmol·L-1 decorin），将人脐静脉内皮细胞按照每孔50×103个细胞接种至涂抹基质胶的Transwell的上室中，依据组别分别给予普通培养液（5.5 mmol·L-1右旋葡萄糖）、高糖培养液（25 mmol·L-1右旋葡萄糖）及含甘露醇的培养液（5.5 mmol·L-1右旋葡萄糖+19.5 mmol·L-1甘露醇）培养16 d［4］，为模拟糖尿病过程中发生的缺氧，第14天时更换无血清培养液，饥饿12 h后向高糖低氧组及甘露醇对照组中加入100 μmol·L-1 CoCl2刺激，decorin组在CoCl2刺激之前加入100 nmol·L-1 decorin孵育2 h。细胞接种后每3 d检测一次跨内皮细胞电阻（transendothelial electrical resistance，TER），隔日换液。
1.2.5　FITC-dextran渗透性检测　人脐静脉内皮细胞按照上述分组和实验方法接种及处理后第16天，采用FITC-dextran作为示踪剂检测单层人脐静脉内皮细胞的渗透性。弃去原培养液，将FITC-dextran（100 μg·mL-1）加入Transwell的上室，90 min后收集下室的培养液，采用多功能酶标仪检测488 nm处各组培养液的吸光度值。
1.2.6　Western blotting检测claudin-5、occludin、ZO-1及p-p38MAPK/p38 MAPK的表达　分组及处理同1.2.4，高糖低氧刺激后48 h，提取人脐静脉内皮细胞的总蛋白并通过BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，按照每孔50 μg经电泳分离后转膜，50 g·L-1脱脂奶粉室温封闭1 h后，分别孵育抗claudin-5、occludin 及ZO-1抗体（稀释比例1∶100）；抗p38 MAPK及p-p38 MAPK抗体（稀释比例1∶1000）；孵育二抗后显影。重复3次。
1.3　统计学处理　所有实验均重复3次，结果采用 SPSS 16.0软件进行处理，各组实验数据以均数±标准差（x?±s）表示，多组比较用单因素方差分析，组间比较用SNK检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　不同浓度decorin处理后人脐静脉内皮细胞的存活率　CCK-8检测发现，10 nmol·L-1、50 nmol·L-1、100 nmol·L-1、200 nmol·L-1 decorin处理人脐静脉内皮细胞 24 h后，各组人脐静脉内皮细胞的存活率均大于90%，差异无统计学意义（均为P>0.05，见表1）。此外，采用显微镜观察各组细胞形态学改变，未观察到明显的细胞形态学变化。



2.2　ELISA检测不同浓度decorin对高糖低氧条件下人脐静脉内皮细胞分泌血管内皮生长因子的影响　ELISA结果显示，0 nmol·L-1 decorin组在高糖低氧环境刺激6~48 h后血管内皮生长因子的浓度明显升高，分别为（42.75±2.49）pg·mL-1、（102.25±4.70）pg·mL-1、（115.96±3.16）pg·mL-1、（374.77±1.25）pg·mL-1，呈时间依赖性，其中孵育48 h后，血管内皮生长因子浓度升高最为明显，与正常对照组（131.12±1.14）pg·mL-1相比，差异有统计学意义（P<0.05）。因此，高糖低氧刺激以48 h为宜。高糖低氧刺激48 h后，0 nmol·L-1 decorin组、100 nmol·L-1 decorin组及200 nmol·L-1 decorin组中血管内皮生长因子的浓度分别为（374.77±1.25）pg·mL-1、（157.93±5.34）pg·mL-1及（183.68±1.14）pg·mL-1，0 nmol·L-1 decorin组与100 nmol·L-1 decorin组及200 nmol·L-1 decorin组相比，差异均有统计学意义（均为P<0.05），而100 nmol·L-1 decorin组与200 nmol·L-1 decorin组间差异无统计学意义（P>0.05，见图1）。



2.3　TER的改变　在接种后14 d，单层人脐静脉内皮细胞的TER达到最大值且趋于稳定为（170.67±9.07）Ω。与正常对照组比较，高糖低氧处理48 h后，高糖低氧组的TER显著降低至（97.33±6.11）Ω，而decorin组的TER能够维持在（157.67±11.72）Ω，与高糖低氧组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.4　FITC-dextran检测单层人脐静脉内皮细胞的屏障功能　高糖低氧处理48 h后，高糖低氧组FITC-dextran的渗透性明显增加，488 nm处的吸光度值为正常对照组的（2.12±0.07）倍（P< 0.05）。加入100 nmol·L-1 的decorin处理后，FITC-dextran的渗透性明显减少，吸光度值是正常对照组的（1.16±0.03）倍，与高糖低氧组的差异有统计学意义（P<0.05）。
2.5　Claudin-5、occludin、ZO-1及p-p38 MAPK/p38 MAPK的表达　高糖低氧处理48 h后，高糖低氧组紧密连接蛋白claudin-5表达量为0.38±0.05、occludin为0.43±0.02及ZO-1为0.25±0.02，与正常对照组表达量0.72±0.05、0.90±0.01和0.75±0.02相比，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。decorin组claudin-5、occludin及ZO-1表达量分别为0.65±0.08、0.87±0.03和0.60±0.01，与高糖低氧组相比，差异均有统计学意义（均为P<0.05，见图2）。高糖低氧组p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值增加，为 0.88±0.02，而decorin组p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值（0.58±0.04）接近正常对照组水平（0.56±0.02），与高糖低氧组比较，差异有统计学意义（P<0.05，见图3）。




3　讨论
    血-视网膜屏障的破坏及血管渗透性增加是视网膜病变病理改变的重要特征，可以导致视网膜缺血缺氧及水肿形成，对视功能产生严重影响［5］。多项研究表明，多重酪氨酸激酶受体抑制剂具有治疗视网膜新生血管及视网膜水肿的作用［6］。decorin是一种新型的多重酪氨酸激酶受体抑制剂［7］，通过结合多种细胞外基质成分与生长因子，在细胞的增殖、存活、分化及血管生成中发挥重要作用。前期研究已表明，decorin能够抑制低氧状态下的视网膜色素上皮细胞分泌低氧诱导因子-1及血管内皮生长因子［8］并维持高糖低氧条件下视网膜色素上皮细胞的屏障功能［2］。然而，decorin对内皮细胞屏障功能的保护作用仍有待研究。大量实验研究表明，血管内皮生长因子不仅能够促进新生血管形成，也是导致血-视网膜屏障破坏的关键因子，通过下调血管内皮细胞间紧密连接蛋白的表达水平引起血管渗透性增加［9-10］，由此可见视网膜病变环境下血管内皮生长因子是影响血-视网膜内屏障功能的重要因素。因此，本次实验首先通过ELISA检测了高糖低氧条件下不同浓度decorin对血管内皮生长因子分泌的影响，发现decorin浓度为100 nmol·L-1时即可有效抑制血管内皮生长因子的分泌，由此我们认为该浓度可能是decorin发挥屏障保护作用的最低有效剂量。研究中我们通过高糖低氧刺激模拟视网膜病变的体外环境，采用100 nmol·L-1 decorin预处理人脐静脉内皮细胞后发现高糖低氧导致的内皮细胞TRE降低和细胞间渗透性增加的现象均得到明显改善，说明视网膜病变中decorin对血-视网膜内屏障具有重要的保护作用，同时decorin对血-视网膜内屏障的调控作用可能部分是通过抑制血管内皮生长因子来实现的。
    血-视网膜屏障正常功能的发挥主要依赖于紧密连接蛋白的完整性，claudin-5、occludin及ZO-1是三种研究最为广泛的紧密连接蛋白［5］。大量研究表明，视网膜病变能够导致紧密连接蛋白的表达下调，破坏血-视网膜屏障［5，11-12］。有研究发现，玻璃体内注射血管内皮生长因子受体诱导剂KH902，能够抑制糖尿病大鼠视网膜内皮细胞紧密连接蛋白（claudin-5、occludin）的表达下调，保护糖尿病大鼠血-视网膜内屏障的功能［13］；多重激酶抑制剂阿西替尼可通过抑制低氧条件下人脐静脉内皮细胞紧密连接蛋白（occludin、ZO-1）的表达下调，缓解低氧诱导的人脐静脉内皮细胞的渗透性增加［6］。本研究使用高糖培养人脐静脉内皮细胞后加入CoCl2来模拟糖尿病过程中血糖升高和局部缺氧的病理改变［2］，经诱导后发现三种紧密连接蛋白（claudin-5、occludin及ZO-1）的表达水平出现明显下调而decorin的干预能够显著抑制紧密连接蛋白的表达下调，表明decorin能够通过作用于紧密连接蛋白保护高糖低氧条件下人脐静脉内皮细胞的屏障功能。
    视网膜病变的发生是多因素、多通路参与的复杂病变过程。本研究中在证实decorin对高糖低氧条件下血-视网膜内屏障功能的保护作用的同时，还发现decorin还可以抑制p38 MAPK信号通路的活化，说明 p38 MAPK通路是decorin在高糖低氧条件下发挥调节作用的路径之一。p38 MAPK作为MAPK信号通路中一条主要的信号通路，在视网膜病变中被激活并参与破坏血-视网膜屏障［14］。ADACHI等［15］研究发现p38 MAPK抑制剂能够明显抑制内质网应激所介导的claudin-5表达水平的下调，降低FITC-dextran的渗漏率。此外，已有研究表明，decorin及decorin类似物可通过结合多种酪氨酸激酶受体抑制p38 MAPK信号通路的磷酸化水平［16-17］。本研究观察到高糖低氧条件下，人脐静脉内皮细胞中p38 MAPK信号通路磷酸化水平升高，而decorin处理组高糖低氧诱导的磷酸化水平升高受到抑制。因此，我们推断decorin可能通过调节p38 MAPK信号通路的磷酸化水平发挥对单层人脐静脉内皮细胞屏障功能的保护作用。
    本实验的不足在于未采用人视网膜内皮细胞进行血-视网膜内屏障的研究。人脐静脉内皮细胞与人视网膜内皮细胞同属血管内皮细胞，拥有内皮细胞共有的细胞外紧密连接蛋白，这些紧密连接蛋白参与构成内皮细胞屏障，调节细胞外液、营养物质及代谢产物的渗透性［18］。已有研究表明，糖尿病诱导血清视黄醇结合蛋白4升高后，能够同时诱导人脐静脉内皮细胞及人视网膜内皮细胞发生炎症反应，导致血管渗透性增加［19］。人脐静脉内皮细胞也曾用于检测纤溶酶原激活物抑制剂对血-视网膜屏障的保护作用［20］。此外，在探讨内源性损伤因子S100 A8及S100 A9对内皮细胞屏障功能的破坏作用时，也有人通过培养人脐静脉内皮细胞并检测紧密连接蛋白ZO-1水平来进行研究［21］。因此，本实验采用人脐静脉内皮细胞替代人视网膜内皮细胞具有可行性。
    本次实验通过检测TER、FITC-dextran的渗透性及紧密连接蛋白的表达水平，证实了decorin对高糖低氧条件下单层人脐静脉内皮细胞屏障具有保护作用。通过Western blotting检测p38 MAPK的磷酸化水平，进一步说明了这种保护作用可能是通过抑制p38 MAPK信号通路的激活来实现的。因此，decorin将可能成为控制视网膜病变发生发展的一种潜在治疗药物，对延缓视网膜病变的发展具有重要的临床意义。