《眼科新进展》  2017年4期 330-334   出版日期：2017-04-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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rno-miR-30b-5p在葡萄膜炎发病过程中对白细胞介素-10和Toll样受体4表达的调控作用


    葡萄膜炎是一类眼科常见的致盲性眼病，通常是由免疫因素引起，但确切的致病机制尚未完全明确。Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）作为一种模式识别受体可通过胞外段识别配体和信号转导介导多种细胞因子的产生，参与葡萄膜炎的发生发展^［1］；白细胞介素10（interleukin-10，IL-10）是一种强有力的抗炎物质，它可抑制辅助性T细胞产生细胞因子及其活性，能够在多种炎症中发挥重要的免疫保护作用^［2］。
    MicroRNAs （miRNAs）是一种长度约为22个核苷酸的高度保守的非编码单链RNA，主要通过与目标mRNA基因的3’端非编码区域（3’UTR）完全或不完全互补配对，进而调控靶基因的表达。我们前期研究发现^［3］，rno-miR-30b-5p可调控包括IL-10、TLR等多个基因的表达，从而在葡萄膜炎的发生发展中发挥重要作用。本研究拟通过构建IL-10、TLR4基因的3’UTR荧光素酶质粒载体和动物实验，鉴定rno-miR-30b-5p对IL-10、TLR4表达水平的影响，进而探讨miRNA在葡萄膜炎的发病过程中对相关炎症细胞因子的调控作用。
1　材料与方法
1.1　实验动物与分组　随机选择12只雌性Lewis大鼠（6~8周，体质量160~180 g，北京维通利华实验动物有限公司）分别在6只大鼠后肢足垫、两侧腹壁及躯干上皮下注射含有光感受器间维生素A类结合蛋白（interphotoreceptor retinoid binding protein,IRBP）（每只100 μg）、完全弗氏佐剂（complete Freund’s adjuvant,CFA）（每只150 μL）、结核分枝杆菌H37RA（TB）（每只100 μg）和无菌PBS（每只150 μL）混合的乳糜液制备实验性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis，EAU）大鼠模型；另外6只大鼠在相同的部位注射等量只含CFA、TB和无菌PBS的乳糜液作为对照组。在免疫后12 d，两组静脉注射过量50 g·L^-1水合氯醛溶液处死大鼠，无菌条件下分离淋巴结和脾脏组织。
1.2　主要试剂和仪器　XhoI、NotI限制性核酸内切酶、DNA聚合酶（赛默飞世尔科技公司Thermo公司），质粒抽提试剂盒、DNA 纯化回收试剂盒、DH5α感受态细胞（天根生化科技有限公司），IRBP(1177-1191；氨基酸序列，ADGSSWEGVGVVPDV,上海生工生物工程股份有限公司合成)，CFA（美国Sigma公司），TB（美国Difco公司），microRNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）；cDNA逆转录试剂盒、ZX-SYBR Green试剂盒、实时荧光定量PCR仪（RT-PCR仪，美国Roche公司），IL-10、TLR4大鼠ELISA试剂盒（武汉基因美生物科技有限公司）。
1.3　IL-10、TLR4基因的3’UTR荧光素酶质粒载体和突变质粒载体的构建及靶点鉴定
1.3.1　引物合成及目的基因片段获取　对IL-10、TLR4基因序列及载体序列进行分析，用XhoI、NotI两个限制性核酸内切酶和RT-PCR获得IL-10、TLR4基因的3’UTR序列。IL-10上游引物：5’-GGCGGCTCGAGTAGAAGCCTACGTGACACT-3’，下游引物：5’-AATGCGGCCGCACAACAGACACCACAAAGT-3’；TLR4上游引物：5’-GCGCTCGAGGGAGTACAAAACTCTGCGCC-3’，下游引物：5’-AATGCGGCCGCAGTTTATAGTCAAGGCAAGG-3’。以IL-10、TLR4基因的3’UTR序列为模板，利用PCR定点突变在引物上引入突变碱基。其中IL-10上游突变引物：5’-TGCAGAGCACAAATGCAATGGTGTCCTTTCA-CT-3’，下游突变引物：5’-CACCATTGCATTTGTGCTCTGCAGCTCTTAAGT-3’；TLR上游突变引物：5’-GCGCTCGAGGGAGTACAAAACTCTGCGCCTAAA-ACCCATTAACAAATGTATTTCCGAATGCTACAGT-3’，下游突变引物：5’-GCGCTCGAGGGAGTACAAAACT-CTGCGCC-3’。PCR反应条件：98 ℃预变性2 min，循环内98 ℃变性10 s，从65 ℃每个循环降1 ℃退火，72 ℃延伸30 s，10个循环；98 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，15个循环；PCR反应循环后72 ℃继续延伸3 min，4 ℃保存备用。
1.3.2　质粒载体的构建与鉴定　构建IL-10、TLR4基因3’UTR荧光素酶质粒载体和突变质粒载体，先将IL-10、TLR4基因的3’UTR区用XhoI、NotI两个限制性核酸内切酶分别克隆至载体海肾荧光素酶基因下游位点，以海肾荧光素酶基因作为报告基因，以萤火虫荧光素酶基因作为内参基因，由于miRNA是通过3’UTR区作用于靶基因，因此通过检测海肾荧光素酶活性的相对变化来验证miRNA对该靶标是否有调控作用。将构建好的载体产物转化到DH5α感受态细胞中混匀，涂布于含Amp的LB固体培养基的平板上，37 ℃培养12~16 h，挑取2个单菌落，先进行菌落的PCR鉴定，反应条件为：95 ℃预变性3 min，循环内95 ℃变性30 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，20个循环；PCR反应循环后72 ℃继续延伸3 min，然后4 ℃保存备用。通过PCR鉴定为阳性的菌落进行测序和比对分析，鉴定正确后大量扩增重组质粒。
1.3.3　293T细胞转染　293T细胞于37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱常规培养。上述质粒构建完成后分别与rno-miR-30b-5p模拟物（mimic）在含有293T细胞的96孔板中培养24 h（初始浓度为每孔10×10³~50×10³个悬浮细胞），使转染时的细胞密度达到50%~80%，按照Lipofectamine^TM 2000转染试剂盒说明书进行转染。实验设置：将野生型和突变型质粒载体分别与rno-miR-30b-5p mimic共转染，加入miRNA 作为阴性对照组，定量检测双荧光素酶催化产生的荧光值，以鉴定miRNA作用靶点。
1.3.4　双荧光素酶鉴定miRNA作用靶点　将rno-miR-30b-5p mimic与IL-10、TLR4基因的3’UTR荧光素酶质粒载体和突变质粒载体共转染48 h后吸出培养基，加入PBS和荧光素酶底物，振荡，用荧光照度计测定荧光数值。将各孔报告基因和内参基因的荧光值比值与对照孔的比值进行统计分析。相对荧光值=（A_{实验组报告基因}/A_{实验组内参基因}）/（A_{对照组报告基因}/A_{对照组内参基因}），A代表荧光值。实验重复三次，结果用均值±标准差表示。
1.4　检测方法
1.4.1　RT-PCR检测rno-miR-30b-5p和IL-10、TLR4 mRNA的表达　为了进一步探讨rno-miR-30b-5p、IL-10、TLR4在EAU大鼠中的作用机制，通过RT-PCR检测EAU大鼠脾脏和淋巴结中rno-miR-30b-5p、IL-10和TLR4 mRNA的表达水平。分别取对照组和EAU大鼠的脾脏和淋巴结，按micro-RNA提取试剂盒说明书提取脾脏和淋巴结组织中的miRNA和总RNA，使用cDNA逆转录试剂盒进行cDNA的合成，用RT-PCR检测rno-miR-30b-5p和IL-10、TLR4 mRNA的表达。实时荧光定量PCR反应体系共20 μL，每个基因设3个复孔。U6 反转录引物:5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’，双向引物序列包括上游引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物:5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；rno-miR-30b-5p反转录引物:5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACT GGATACGACAGCTGA-3’，双向引物序列包括基因特异性引物：5’-GGGCTGTAAACATCCTACAC-3’，反向引物：5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’；β-actin上游引物:5’-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3’，下游引物:5’-CCCATACCCACCATCACACC-3’；IL-10上游引物:5’-TTCCATCCGGGGTGACAATAA-3’，下游引物:5’-TTCTGGGCCATGGTTCTCTGC-3’；TLR4上游引物:5’-GATGGCATATTTCTTGGCTTGAT-3’，下游引物:5’-GGATGTCTCTATGCGATTGAAACT-3’。反应条件为：95 ℃ 5 min，循环1次；95 ℃ 20 s，55 ℃ 25 s，循环共45次。采用2^-△△Ct方法进行计算，U6为rno-miR-30b-5p的内参，以β-actin为IL-10和LTR4的内参，反应结束后对各组rno-miR-30b-5p和IL-10、TLR4 mRNA的相对表达量进行定量分析。
1.4.2　ELISA检测IL-10和TLR4蛋白的表达　将冻存在-80 ℃冰箱中的对照组和EAU组大鼠的淋巴结和脾脏取出，快速放入液氮中，加入400 μL裂解液（每1 mL RIPA裂解液加2 μL蛋白酶抑制剂，混匀），玻璃研磨棒研磨后超声波细胞粉碎机超声20 min，8000 r·min^-1、4 ℃离心20 min，吸取上清转移到新EP管中，通过ELISA试剂盒检测IL-10和TLR4蛋白的表达水平，实验步骤严格按照IL-10和TLR4试剂盒说明书进行。
1.5　统计学方法　所有实验均重复三次，采用SPSS 17.0统计学软件分析数据，计量资料均以x?±s表示，各组脾脏和淋巴结的rno-miR-30b-5p、IL-10、TLR4 mRNA和蛋白表达含量比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　IL-10、TLR4质粒载体和突变质粒载体的构建　经RT-PCR反应扩增目的基因IL-10、TLR4片段，引物扩增产物总长度分别为763 bp、628 bp，得到的PCR产物行15 g·L^-1琼脂糖凝胶电泳分析结果显示，扩增目的基因片段大小分别为763 bp、628 bp（图1A、B），与理论长度一致；对挑选出的阳性单克隆菌落进行PCR反应，引物扩增条带理论大小分别为1000 bp、850 bp，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析后可见明亮的单一条带，实际条带扩增大小分别为1000 bp、850 bp（图1C、D），与理论长度一致。



2.2　双荧光素酶检测质粒载体与rno-miR-30b-5p mimic转染细胞后IL-10、TLR4的表达量　双荧光素酶报告基因表达分析结果显示，与阴性对照组相比，rno-miR-30b-5p mimic对IL-10和TLR4野生型的报告荧光均有较明显的下调作用（均为P<0.01，见图2），对其预测靶位点进行突变后，突变型载体中的报告荧光也存在明显的下调作用（均为P<0.01）。



2.3　rno-miR-30b-5p在两组大鼠脾脏和淋巴结中的表达　与对照组相比，EAU组大鼠脾脏和淋巴结中rno-miR-30b-5p均有明显的下调表达（均为P<0.01，见图3）。
2.4　IL-10和TLR4 mRNA和蛋白表达　与对照组相比，EAU大鼠脾脏和淋巴结中IL-10 mRNA和TLR4 mRNA表达明显升高，差异均有统计学意义（均为P<0.01，见图4A、B）；IL-10蛋白和TLR4蛋白表达趋势和基因表达趋势一致，且与对照组相比，表达水平差异均有统计学意义（均为P<0.05，见图4C、D）。




3　讨论
    目前研究表明，葡萄膜炎的发生发展是涉及免疫、炎症等因素在内的多基因调控表达的复杂过程。多种因子的异常表达在葡萄膜炎的发生发展中起重要作用。最近的研究表明，miRNA参与了调节生理或疾病状态中的多个进程，包括细胞死亡或凋亡、肿瘤的发生发展以及炎症反应等^［4］。作为非编码RNA，microRNA通过与靶mRNA 3’UTR结合，降解靶基因或者抑制转录后的翻译水平^［5-8］，进而影响细胞的分化、增殖和凋亡，并在生物生长发育和疾病发生发展过程中发挥重要的调节作用。如miRNA可以结合在免疫细胞的TLRs上，调控肿瘤的生长和迁移、诱发炎症应答或影响机体内在的免疫水平，并可通过调节TLR/IL-1受体的表达水平而影响炎症因子的表达^［9-10］；miR-223通过激活PI3K/AKT途径阻断TLR4信号通路，进而抑制动脉粥样硬化的发展^［11］；在TLR4介导的单核细胞中，IL-10诱导的miRNA-187可能通过负调节方式对TNF-α、IL-6和IL-12p40的表达水平进行精密调节^［12］。本研究通过miRNA芯片进一步研究发现，与正常大鼠的淋巴细胞中的miRNA水平相比，EAU大鼠的淋巴细胞中有多条miRNA表达发生异常。对这些有表达差异的miRNA调控的靶基因进行信号通路分析，发现这些miRNA可调控包括炎症因子、TLR、MAP3K以及自噬基因等在内的多种信号通路，而rno-miR-30b-5p可能同时调控TLR4、IL-10、IL-21R等多种基因的表达进而影响葡萄膜炎的发生发展进程^［3］。
    miRNA通过与靶基因的3’UTR结合可以负调控其靶基因的表达，从而影响动物机体的发育，甚至调控疾病的发展进程。我们前期研究发现^［13］，在已建立的葡萄膜炎大鼠外周血中存在IL-17和IL-10的表达，并且发现与正常大鼠相比，葡萄膜炎大鼠中IL-10的表达水平从第4天开始升高，在第16天时达到高峰。本研究结果发现，在EAU大鼠中rno-miR-30b-5p可以负调控IL-10、TLR4的表达，与对照组相比，rno-miR-30b-5p在葡萄膜炎大鼠脾脏和淋巴结中的表达下降。表达下降的rno-miR-30b-5p无法与表达IL-10和TLR4基因的相关位点结合，从而不能有效抑制IL-10和TLR4的表达，致使脾脏和淋巴结中IL-10和TLR4的表达升高，进而影响EAU的发展进程。因此，miRNA有可能成为治疗EAU的新靶点。
    本研究成功构建了IL-10、TLR4质粒载体和突变质粒载体，并将其与rno-miR-30b-5p mimic成功转染到293T细胞中，通过RT-PCR扩增的目的基因和筛选的阳性菌落与理论长度一致，进而通过双荧光素酶验证了rno-miR-30b-5p对IL-10和TLR4有较明显的下调作用，对其预测靶位点进行突变后，突变型载体中的报告荧光也存在明显的下调作用，说明rno-miR-30b-5p可能并不是通过该位点起作用或许存在其他的结合位点。通过动物实验进一步验证了rno-miR-30b-5p对IL-10、TLR4的调控作用，在EAU大鼠脾脏和淋巴结中rno-miR-30b-5p显著的下调表达和IL-10、TLR4明显的上调表达，证实IL-10和TLR4是rno-miR-30b-5p调控的靶基因，rno-miR-30b-5p可以负调控IL-10、TLR4的表达。该结果为进一步在体内外观察rno-miR-30b-5p对葡萄膜炎发生发展的影响和探究其分子机制奠定了基础。