《眼科新进展》  2017年4期 317-320   出版日期：2017-04-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

---

强光照致TgAPPswePS1转基因鼠视网膜功能障碍和结构损伤


    阿尔茨海默病（Alzheimer’s dieasea，AD）是年龄相关退行性疾病^［1］，转基因动物是目前最好的AD研究实验对象。现今，研究者们普遍集中在单一的对转基因动物视网膜进行研究，也已经发现AD转基因动物视网膜上存在结构异常^［2-3］，但是对AD转基因动物在环境因素干预下的变化却不甚了解，考虑光照因素是眼部接受的环境因素之一，且光照损伤是视网膜疾病中的一个重要环境因素，那么是否光照损伤可以引起AD转基因鼠视网膜功能结构的变化？为此，本实验选择AD转基因鼠TgAPPswePS1为研究对象，研究在光照损伤作用下TgAPPswePS1转基因鼠视网膜结构和功能变化，为AD相关的眼部变化提供环境保护模式。
1　材料与方法
1.1　实验动物和分组　TgAPPswePS1小鼠［B6C3-Tg（APPswe，PSEN1dE9）85Dbo/J（Tg）］由Jackson Laboratory实验室（Bar Harbor，ME，美国）购买引进繁殖。本研究对所有转基因鼠都进行了基因型鉴定。研究中取APPswe（+）与PSEN1dE9（+）的AD转基因鼠为实验鼠。筛选鼠龄为6个月的阳性转基因小鼠共12只，其中实验组和对照组各6只。
1.2　实验仪器与试剂　切片机Cm1850-1-1（德国leica公司），荧光显微镜（德国蔡司Axioylan2），罗兰电生理仪（德国RETIPORT公司），40 g·L^-1多聚甲醛（美国Sigma公司），复方托吡卡胺（沈阳兴齐制药公司）。
1.3　方法
1.3.1　光照处理　实验组小鼠均应用动物光损伤装置（专利ZL201620227064.X）给予光照干预，设光照度为10 000 lux，每天光照12 h，光照处理6个月，在光照过程保持小鼠瞳孔散大。对照组于正常环境中饲养。
1.3.2　视网膜电图检查　视网膜电图（electroretinogram，ERG）检查按照文献［4］的方法进行。在光照6个月即小鼠12个月大时两组小鼠均行ERG检查，行ERG检查前所有小鼠均暗适应过夜至少8 h，复方托吡卡胺散瞳后，43 g·L^-1水合氯醛腹腔注射麻醉，角膜上滴5 g·L^-1普鲁卡因表面麻醉，然后于角膜上放置角膜电极，于尾巴上皮下插入接地电极，舌形参考电极放置在舌下。在-25 dB白色闪光刺激下获得Rod反应，在0 dB白色闪光刺激下获取Max反应，3 s内3次独立的刺激合成一个反应，每眼测量3次反应，分别获得a、b波的波幅、潜伏期等数据，取平均值进行统计。
1.3.3　石蜡切片和免疫组织化学染色　光照6个月（即小鼠鼠龄为12个月）时终止实验。切片和免疫组织化学染色按照文献［5］的方法进行：两组小鼠均于麻醉并心脏灌注后取眼球，40 g·L^-1多聚甲醛常温下固定24 h，置于4 ℃备用。予以石蜡切片：常规漂洗后，梯度乙醇脱水，二甲苯浸泡45 min，在熔点为52~56 ℃的软蜡中浸泡15 min×2次，浸蜡的组织块放入包埋框中，硬蜡（熔点为60~62 ℃）包埋，蜡块备用。切片机连续切片，厚约4 μm。切片贴附于载玻片上，双蒸水浸泡5 min，以保持最好细胞形态；苏木素染料中浸泡15 s，流水下冲片直至深紫色变为浅紫色；在体积分数1%的稀氨水-HCL中停留60 s，使得苏木素着色区变为淡蓝色；流水冲片，双蒸水中浸泡5 min；5 g·L^-1伊红2~3 min染细胞浆，流水洗；染色后，常规依次经体积分数80%（1 min×2次）、95%（3 min×2次）、100%（5 min×2次）乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并采集图像。
1.4　图像采集、统计分析　ERG检查获得数据、视网膜切片HE染色图像采集都由一人独立完成，在相同实验条件下采集图像，由专门人员进行统计分析。视网膜厚度计数：取经视盘非连续性切片，HE染色后使用Photoshop9中的ruler工具，在距视盘300~600 μm处测量视网膜内界膜到视网膜外节的距离。
    所有数值型实验数据均以均数±标准差表示（x?±s），组间均数两两比较采用SPSS 19.0软件中Student’t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2　结果
2.1　光照干预下TgAPPswePS1鼠视网膜电生理改变　实验组和对照组小鼠光照后ERG波形图见图1。a、b波波幅值见表1，潜伏期见表2。
    由图1可知，对照组Rod波形明显，存在明确的a波和b波波形，给予光刺激后从a波快速上升，形成平台，到达b波（图1A）。实验组ERG也检测到Rod反应，但是Rod反应的波形较对照组明显低矮变平，甚至个别呈现为直线型，类似熄灭改变（图1C）；由于a波波形往往呈直线型，导致a波波幅值常不明显，接近基线，数值采集困难，故本研究结果显示Rod-a波波幅同对照组比较虽有下降，但是下降不明显，差异无统计学意义（P>0.05）；Rod-b波波幅同对照组比较下降幅度大，差异有统计学意义（P<0.05），波形变平坦。
    对照组Max反应检测示，Max反应存在明确的a波和b波波形（给予光刺激后出现的第一个波谷即为a波，继而出现波峰再迅速上升形成最高的波峰即为b波；图1B）。实验组与对照组相比，Max-a波、b波波幅均下降明显，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；甚至在部分实验组转基因小鼠上，Max反应波形呈熄灭状改变，考虑为光照6个月后，视网膜损伤过大导致波幅过小而无法被机器识别所致。
    在Rod与Max反应的a、b波潜伏期，实验组与对照组间比较，差异均无统计学意义（均为P>0.05），说明视网膜电生理检查中，Rod与Max反应的a、b波的潜伏期均没有受到损害。





2.2　光照损伤TgAPPswePS1小鼠视网膜结构改变　对照组视网膜各层结构完整，未见明显异常改变。经光照损伤后，实验组视网膜结构存在明显变化：外核层与感光细胞外节明显变薄，甚至在个别实验组小鼠仅剩下1~2层外核层，感光细胞外节消失，呈缺失性改变；对组织切片进行视网膜厚度测量，发现对照组和实验组的视网膜厚度分别为（181.32±13.47）μm和（102.34±9.38）μm，二者相比差异具有统计学意义（P=0.017）。
3　讨论
    关于AD转基因鼠视网膜结构的研究已有报道^［3，6］，但是对在环境因素下的其视网膜功能的变化却研究甚少。光照暴露已经被证实是许多视网膜疾病的相关危险因素^［7-10］，但是光损伤对AD疾病模型鼠的视网膜影响如何却甚少研究。为了探讨AD转基因鼠暴露在光照损伤因素下的视网膜功能结构改变，本研究将AD转基因鼠置于光急性损伤模型下。据以往研究报道，视网膜电生理检查是小鼠视功能比较客观的检查手段^［10］，ERG的a、b波波幅下降代表视网膜功能减退；在本研究中，AD转基因鼠接受光照损伤后，视网膜ERG的Rod和Max反应发生明显改变，尤其以a、b波的波幅下降明显，与此同时，HE染色结果示视网膜厚度变薄，结合两者结果，强烈提示光照可以造成AD转基因鼠视网膜急性损伤性改变。
    ERG中a波代表视网膜外层功能，提示光感受器的变化，b波指示视网膜胶质细胞的功能，当视网膜外层结构发生改变时，必然存在a、b波波幅的变化，本研究结果提示光感受器层、外核层受损，结合ERG的a、b波波幅下降，说明光照损伤AD转基因鼠视网膜功能改变同结构改变是一致的，提示光照损伤可以导致AD转基因鼠视网膜结构功能发生明显改变；此结果同已有的研究报道基本一致^［10-11］，都提示光照存在损伤视网膜结构功能的潜在危险性。
    本研究发现光照刺激转基因鼠后，视网膜ERG的a、b波潜伏期未发生改变，同之前的光损伤研究报道基本相一致^［11］，考虑到视网膜结构的变化，说明急性光照对AD转基因鼠视网膜突触连接可能影响不大，但是因为ERG潜伏期提示的仅为视网膜对光线应答的起始，只要有细胞存在应答，就可以表现在潜伏期上无变化，故而在本研究中的提示意义有限。
    需要指出的是转基因鼠光照后感光细胞外节和外核层明显改变，严重损伤的视网膜外核层往往仅留下1~2层结构，感光细胞外节完全消失，呈缺失样改变，在我们的ERG结果中，发现在某些个例里存在ERG呈熄灭状，所以功能异常同结构改变是一致的，都提示了高强度光照对AD转基因鼠视网膜的严重损伤作用，这种严重破坏的现象已有报道^［12］，但这种报道仅在白化大鼠上存在，所以推测AD转基因鼠的这种改变应该同本研究设定的研究条件有关，除了考虑到设定的光照损伤为急性强损伤外，已有研究报道AD转基因小鼠的视网膜结构存在改变^{［4，13-15］}，这种改变就包括视网膜厚度的减少，视网膜结构中某些突触存在损伤，那么极有可能是转入的AD致病基因与光照损伤存在一定的关联性，且可能两者呈协同性作用，转入的AD基因对光照损伤产生了放大效应，才致使视网膜结构剧烈变化，至于其中的具体机制尚不清楚；是否有其他因素的参与，ERG的结果没有进一步提示，有待进一步研究。
    考虑到本研究仅选择了一个时间点，不存在连续性观察，所以无法提示光照对转基因小鼠视网膜损伤的始动机制，也无法判断损伤的过程，急性损伤的具体过程有待进一步研究；由于本研究选择光照参数过强，导致视网膜急性破坏严重，而无法模拟现实中的慢性损伤过程，也因此减弱了本研究的实际意义。
    综上所述，给予AD转基因小鼠光照损伤因素，可以引起视网膜结构和功能的损伤，其具体机制有待进一步研究。