《眼科新进展》  2017年4期 305-309   出版日期：2017-04-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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贝伐单抗对视网膜色素上皮细胞抗氧化功能的影响


    年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD）是发达国家≥50岁人群不可逆视力丧失的首要原因，随着我国社会人口的老龄化及生活模式的改变，AMD发病率也逐年上升^［1-3］。目前，玻璃体内注射抗新生血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)药物是湿性AMD的一线治疗方法^［4-5］。尽管有大量文献报道抗VEGF治疗的安全性，但随着抗VEGF药物的广泛应用及随访时间的延长，抗VEGF治疗的副作用也逐渐显现。研究发现，抗VEGF治疗会加重脉络膜及视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)的萎缩^［6-7］，并且萎缩的发生与治疗次数有关^［8］，但机制不清。RPE衰老、抗氧化能力下降是AMD的发病机制之一，抗VEGF治疗加重脉络膜萎缩是否与影响了RPE的抗氧化功能有关尚不清楚，因此本研究采用ARPE-19细胞模拟氧化应激环境，体外观察了抗VEGF治疗对细胞抗氧化功能的影响。
1　材料与方法
1.1　材料　ARPE-19（购自美国ATCC公司，CRL-2302），DMEM/F-12培养基（美国Invitrogen公司），胎牛血清（美国Gibco公司），胰蛋白酶（美国Sigma公司），注射用青霉素钠(哈尔滨哈药集团制药总厂)，注射用硫酸链霉素(山东鲁抗医药股份有限公司)，贝伐单抗（瑞士罗氏公司），体积分数3%H₂O₂(美国Sigma公司)，CCK-8试剂盒(上海七海生物公司)，MitoSOX Red（美国Invitrogen公司），线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）（上海碧云天公司）。总RNA提取试剂盒（德国Macherey Nagel公司），反转录试剂盒（日本TaKaRa公司），Real Master Mix(SYBR Green)试剂盒（北京天根生化科技有限公司）。NADPH氧化酶4（NADPH oxidase 4,NOX4)抗体(兔抗人抗体，美国 Abcam 公司)，血红素氧合酶-1（heme oxygenase-1,HO-1)抗体(兔抗人抗体，美国 Abcam 公司)，羊抗兔荧光二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养与实验分组　ARPE-19细胞按产品说明采用DMEM/F-12培养基（含体积分数10%胎牛血清、100×10³U·L^-1 青霉素和0.1 g·L^-1链霉素）在37 ℃、含体积分数5% CO₂的孵育箱中培养，细胞接种于6孔板中，待达到70%~80%融合时，将胎牛血清调整为体积分数2%并加入终浓度为0.25 g·L^-1贝伐单抗，根据贝伐单抗处理时间的不同分为0 h组、12 h组、24 h组、48 h组、72 h组共5组，0 h组为对照组，其余各时间点为实验组。无血清培养液中加入200 μmol·L^-1 H₂O₂处理2 h模拟氧化应激环境。
1.2.2　CCK-8检测各组ARPE-19细胞活性　ARPE-19细胞经胰蛋白酶消化后以每孔1000个接种在 96孔板，于细胞培养箱中待达到70%~80%融合时，更换新鲜培养基按实验分组用终浓度为0.25 g·L^-1的贝伐单抗干预细胞，每组均设置5个复孔。按以上分组予以干预。加入200 μmol·L^-1 H₂O₂作用2 h后，去除培养液，用PBS洗3次，每孔加入10 μL CCK-8试剂和90 μL无血清培养基，培养箱中继续培养3 h后，用自动酶联免疫分析仪，在450 nm吸收波长处测量各组细胞的吸光度值(A₄₅₀)，计算每组的平均值。实验独立重复 3 次，取平均值。
1.2.3　流式细胞仪检测ARPE-19细胞线粒体活性氧产生水平　ARPE-19细胞经胰蛋白酶消化后以每孔50×10³个接种在 6孔板，待达到70%~80%融合时，按以上分组予以干预。加入200 μmol·L^-1 H₂O₂作用2 h后，去除培养液，用PBS洗3次，加入现配的MitoSox Red 1 mL，置于37 ℃、含体积分数5% CO₂的孵育箱避光孵育15 min，吸除染液，PBS洗3次，加入2.5 g·L^-1胰蛋白酶消化，收集细胞后以流式细胞仪检测荧光强度。
1.2.4　线粒体膜电位检测　ARPE-19细胞经胰蛋白酶消化后以每孔50×10³个接种在6孔板，待达到70%~80%融合时，按以上分组予以干预。加入200 μmol·L^-1 H₂O₂作用2 h后，去除培养液，用PBS洗3次，每孔加入现配的1 mL JC-1染色工作液和1 mL培养液，置于细胞培养箱中37 ℃孵育20 min，孵育结束后，吸除染液，用JC-1染色缓冲液（1×）洗涤2次，最后加入2 mL 细胞培养液。激光共聚焦显微镜下观察照相，收集细胞后以流式细胞仪检测荧光强度。线粒体膜电位水平按红色/绿色的荧光强度比值计算。细胞内的荧光信号用激光共聚焦显微镜观察及记录。
1.2.5　RT-PCR 检测 NOX4和HO-1的mRNA表达　在不同时间点收集细胞，按照试剂盒说明提取各组细胞mRNA，并在紫外分光光度计上测量样品在260 nm和280 nm吸收值，确定RNA的浓度及纯度。根据反转录试剂盒说明书对提取的NOX4和HO-1的mRNA 进行反转录。引物由青岛德罗海达生物技术有限公司设计并合成。NOX4上游引物：5’-CAACTGTTCCTGGCCTGACA-3’，下游引物：5’-GCAACGTCAGCAGCATGTAGA-3’；HO-1上游引物：5’-ACACCCAGGCAGAGAATGCT-3’，下游引物：5’-CGAAGACTGGGCTCTCCTTGT-3’；GAPDH上游引物：5’-ATGCTGGCGCTGAGTACGT-3’，下游引物：5’-AGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’。采用ABI 7500 Real-Time PCR系统，按Real Master Mix(SYBR Green)试剂盒说明书加入试剂进行PCR反应。反应条件：95 ℃预变性10 s，95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，共45循环。以2^-△△Ct(Ct代表循环阈值)表示基因的表达量。结果计算公式如下：（1）相对量=2^-△Ct，△Ct=Ct_目的基因-Ct_内参基因；（2）实验组：对照组的相对量2^-△△Ct，△△Ct=△Ct_实验组-△Ct_对照组。以GAPDH为内参。实验独立重复3次，取平均值。
1.2.6　Western blot测定NOX4和HO-1的蛋白表达　不同时间点收集细胞，提取各组细胞总蛋白。BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，按每个样本 50 μg 总蛋白上样，100 g·L^-1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，初始电压设置为80 V，30 min后调整电压为 120 V，约90 min待溴酚蓝跑到板底时，终止电泳；在 4 ℃ 环境下，100 mA 电转膜 3 h，50 g·L^-1脱脂奶粉的TBST液室温封闭 1 h，分别滴加NOX4和HO-1一抗(浓度按照说明书) 4 ℃过夜。第2天滴加辣根过氧化物酶标记的二抗(山羊抗兔 IgG，浓度为1∶2000)室温孵育1 h。免疫反应结束后用Western blot化学发光试剂发光、显影。Gel-Del凝胶成像系统照相，应用Image J图像分析软件，通过目的基因与内参条带的吸光度值比值进行目的蛋白的相对含量分析。实验独立重复3次，取平均值。
1.3　统计学分析　采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，数据用均值±标准差(x?±s)表示。采用单因素方差分析和LSD-t检验对所得的实验数据进行统计学分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　ARPE-19细胞活性测定　贝伐单抗及H₂O₂处理后0 h组、12 h组、24 h组、48 h组、72 h组细胞活性分别为（100.2±3.3）%、（99.2±2.7）%，(102.5±6.4）%、(103.9±3.7) %、（103.6±3.3）%，差异无统计学意义(P>0.05)。
2.2　贝伐单抗对氧化应激状态下ARPE-19细胞内线粒体活性氧水平的影响　采用流式细胞仪检测ARPE-19细胞内线粒体活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生水平，0.25 g·L^-1贝伐单抗处理ARPE-19细胞后，与对照组（23.13±0.86）相比，12 h、24 h、48 h、72 h组的细胞内线粒体ROS水平分别为27.62±0.98、27.55±0.75、28.85±0.71、27.92±0.85均上升，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。
2.3　贝伐单抗对氧化应激状态下ARPE-19细胞线粒体膜电位的影响　结果显示：以对照组线粒体膜电位为参照，0.25 g·L^-1贝伐单抗处理后12 h、24 h、48 h和72 h线粒体膜电位分别为（89.19±0.70）%、（88.96±1.33）%、（74.30±1.28）%和（91.95±1.06）%，较对照组（100.65±0.64）%均降低，48 h达最低，72 h显著回升，差异有统计学意义（P<0.01，见图1）。



2.4　RT-PCR检测各组NOX4和HO-1的mRNA表达　氧化应激状态下，与对照组比较，12 h、24 h、48 h和72 h组NOX4 mRNA相对表达量均增高，差异均有统计学意义(均为P<0.01），且在24 h组NOX4表达最高，之后明显下降，但仍高于对照组。与对照组比较，抗氧化因子HO-1 mRNA 相对表达量在24 h、48 h和72 h组均下降，差异有统计学意义(P<0.01，见图2）。
2.5　Western Blot 检测各组NOX4和HO-1蛋白的表达　氧化应激状态下，与对照组比较，促氧化因子NOX4蛋白相对表达量在12 h、24 h、48 h和72 h组均上升，而且在24 h组表达最高，之后明显下降，但仍高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）；抗氧化因子HO-1蛋白相对表达量在48 h和72 h组均下降，差异均有统计学意义（均为P<0.05，见图3）。




3　讨论
    AMD是发达国家首要致盲眼病，在我国的发病率也呈逐年上升的趋势^［2］。抗VEGF治疗可使90%以上的患者避免视力下降、1/3以上的患者视力提高超过15个字母以上^［9-10］，是目前湿性AMD的首选治疗方法。但研究发现，随着用药及随访时间的延长，抗VEGF治疗的视力获益不能长期维持^［11-12］，而其中重要的原因是黄斑部进行性萎缩^［13］。在病理结构上，黄斑部萎缩最早和最明显的病变是RPE萎缩；又因为抗氧化功能减弱是RPE衰老、凋亡、萎缩的重要原因，因此本研究以RPE的抗氧化功能为指标，探讨抗VEGF治疗是否通过影响RPE细胞的抗氧化功能而参与黄斑部萎缩的发生发展。
    线粒体是细胞内ROS的主要来源，本研究观察了贝伐单抗处理不同时间后，在氧化应激状态下RPE细胞线粒体中ROS含量，发现与对照组相比，实验组各时间点ROS水平均显著增高，表明贝伐单抗增加了RPE氧化损伤的易感性，可以推测反复应用抗VEGF药物可以导致ROS在细胞内蓄积，而过量ROS可以通过氧化应激及过氧化攻击细胞膜、核酸、蛋白质和酶类等生物大分子，最终导致RPE细胞功能严重受损以至衰老、死亡^［14-15］。
    线粒体膜电位是由能量代谢过程中线粒体内膜两侧电子的不对称性形成的跨膜电位，参与ATP的代谢过程，对于维持线粒体功能起到重要作用，是评价线粒体功能完整性的主要指标之一。本研究结果表明临床浓度的贝伐单抗在氧化应激下可使线粒体膜电位下降，至48 h达高峰，72 h则恢复至92%，表明贝伐单抗可以影响线粒体功能，但作用不持久，推测随着时间延长可以恢复至正常水平。MALIK等^［16］发现，1倍、2倍和10倍临床剂量的贝伐单抗可使线粒体膜电位轻度下降。与本研究结果一致的。
    NOX4是NADPH氧化酶家族重要组成成员之一^［17］，正常情况下RPE细胞表达NOX4^［18-19］。NOX4是氧化应激NADPH-ROS途径一个重要的组成部分，NADPH 氧化酶的主要功能就是催化ROS的产生，同时参与了纤维化和炎症的形成^{［17，20-22］}。本研究发现，在氧化应激的条件下，贝伐单抗处理能明显上调NOX4表达，且表达水平是时间依赖性的，48 h和72 h组 NOX4的mRNA和蛋白水平均较前降低；各种细胞均有一系列的保护机制，以防御氧化损伤，抗HO-1是血红素氧合酶，催化血红素降解，被认为是细胞对应激反应的一种重要的抗氧化酶^［23］。本研究发现，在氧化应激条件下，与对照组比较，贝伐单抗处理后的RPE细胞 HO-1 mRNA相对表达量在24 h、48 h和72 h组均降低，蛋白相对表达量在48 h和72 h组降低，差异有统计学意义（P<0.05），说明贝伐单抗可以降低RPE细胞的抗氧化能力。以上结果表明，贝伐单抗可能通过促进氧化损伤、降低抗氧化能力使RPE的抗氧化功能降低，易于发生凋亡、萎缩从而参与抗VEGF治疗后的黄斑部脉络膜萎缩。
    总之，本研究表明，临床浓度的贝伐单抗降低了RPE细胞的抗氧化损伤能力，可能是长期抗VEGF治疗后黄斑部进行性萎缩的原因之一。因此，寻求抗VEGF治疗同时的相应保护措施，或许对维持良好的治疗效果有重要意义。