《眼科新进展》  2017年4期 301-304   出版日期：2017-04-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
lncRNA-MEG3通过P53途径介导视网膜母细胞瘤凋亡


    视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)为婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤，严重危害患儿的视力和生命，寻找理想的肿瘤标记物对于提高RB的诊治水平意义重大。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)［1］是一类长度大于200 个核苷酸的不具有可读框的RNA分子，其与肿瘤的发生发展密切相关，且在多种肿瘤组织和癌前病变组织中有明显的异常表达，既可发挥促癌作用又可起到抑癌功能。母系表达基因3(maternally expressed gene 3，MEG3) 是一个具有肿瘤抑制功能的lncRNA，其高表达或重新表达在某些肿瘤中可以抑制细胞生长和增殖，如乳腺癌［2］、肺癌［3］、宫颈癌［4］ 、骨肉瘤［5］和神经母细胞瘤［6］等。近年研究发现其发挥抑癌作用与P53蛋白有关［6-11］，P53蛋白在肿瘤抑制中起着核心作用，可诱导细胞周期停滞及凋亡，并且能够介导其他抑癌因子的功能［9］。本研究将通过检测RB组织中MEG3的表达水平，观察上调或干扰MEG3表达后RB细胞的功能变化及MEG3对P53蛋白表达的影响，进而分析MEG3在RB发生发展中的作用。
1　材料与方法
1.1　组织标本与细胞系
1.1.1　标本的收集与保存　收集2010年1月至2015年1月间在深圳市人民医院以及南方医科大学珠江医院进行眼球摘除术的RB患者眼球标本21例（含RB组织及正常视网膜组织）。手术切除的新鲜标本立即放入液氮冻存，然后置于-80 ℃冰箱保存。所有患者术前均未行肿瘤相关治疗，术后病理学均证实为RB。实验程序已获深圳市人民医院以及南方医科大学珠江医院伦理学委员会的批准，所有患者已知情同意并签署了知情同意书。
1.1.2　细胞系和培养条件　RB细胞株SO-RB50 及HXO-RB44分别来自中山大学中山眼科中心及中南大学湘雅医学院肿瘤研究所。SO-RB50及HXO-RB44细胞株均用含体积分数10%胎牛血清及含10 g·L-1青-链霉素的高糖DMEM培养液(美国Gibco公司)置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，间隔2~3 d更换培养基。
1.2　方法
1.2.1　RNA提取和实时荧光定量PCR　使用TRIzol试剂（TaKaRa公司，大连）提取组织或培养的细胞中的总RNA。cDNA的合成采用One Step PrimeScript Kit (TaKaRa公司，大连)，并依据操作说明进行。实时荧光定量PCR （qRT-PCR）反应选用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq kit套件。qRT-PCR和数据收集基于CFX96平台(Bio-Rad公司，美国)。在扩增MEG3的同时，还扩增了GAPDH作为内参，MEG3的相对表达量通过2-△△CT法确定。MEG3上游引物：5’-CCTTCCATGCTGAGCTGCT-3’，下游引物：5’-TGTTGGTGGGATCCAGGAAA-3’；GAPDH上游引物：5’-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3’，下游引物：5’-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’。
1.2.2　质粒的构建及siRNA的合成　MEG3过表达质粒为上海吉玛公司合成、鉴定后提供的商用产品，为 MEG3序列亚克隆至pcDNA载体后构建成的质粒，同时上海吉玛公司设计合成了特异性siRNA序列（5’-CCCUCUUGCUUGUCUUACUTT-3’）以下调MEG3表达。空的pcDNA载体及无意义序列作为阴性对照。
1.2.3　质粒及siRNA转染　前期预实验提示SO-RB50细胞的MEG3基础表达量较HXO-RB44细胞低，故后续实验中选用pcDNA-MEG3上调SO-RB50细胞中MEG3表达量，选用siRNA-MEG3下调HXO-RB44细胞中MEG3表达量。将RB细胞株SO-RB50及HXO-RB44按每孔5×105个种于六孔板中，待细胞达到70%融合时，用pCDNA-MEG3和siRNA-MEG3以及相应的阴性对照（转染空载质粒或siRNA无意义序列）通过Lipofectamine 2000（Invitrogen 公司，上海）转染细胞，8 h后更换培养基，48 h后收获细胞用于qRT-PCR检测，72 h后用于Western blot检测。
1.2.4　细胞凋亡实验　转染48 h后，用胰蛋白酶消化液解离细胞，1000 r·min-1离心5 min，弃上清收集细胞，PBS重悬；1000 r·min-1再次离心5 min弃上清，加入500 μL 的Binding Buffer重悬后加入5 μL Annexin V-FITC (eBioscience公司，美国)，避光10 min，再加入10 μL Propidium Iodide，振荡器混匀。在室温下避光反应15 min，随后进行流式细胞仪检测（BD FACSCalibur 流式细胞仪，BD Biosciences公司，美国)，分析并比较早期凋亡细胞的比例。
1.2.5　Western blot检测　细胞经预冷PBS漂洗2 次，置于冰上，经细胞裂解液（RIPA，Thermo Scientific，美国）及超声破碎后，13 000 r·min-1离心10 min收集裂解物总蛋白；用BCA蛋白定量试剂盒（Thermo Scientific，美国）进行蛋白定量，取50 μg细胞总蛋白在100 g·L-1的SDS-PAGE中进行电泳并电转印至PVDF 膜（Roche，瑞士）；PVDF膜经50 g·L-1的脱脂牛奶室温中封闭2 h后，与兔抗人P53（1∶500，Santa Cruz Biotechnology 公司，美国）和内参照GAPDH（1∶1000，Santa Cruz Biotechnology，美国）分别孵育，经漂洗后再与HRP标记的羊抗兔IgG(1∶2000，Santa Cruz Biotechnology，美国)室温中反应2 h，增强化学发光法（ECL）发光试剂（Thermo Scientific公司，美国）显影，然后采用Quantity one 扫描软件分析相对灰度值，并以GAPDH作为内参(1∶1000)，比较实验组与对照组P53蛋白表达水平。
1.3　统计学方法　使用SPSS 20.0软件进行统计分析。所有实验均重复三次，数据以均数±标准差（x?±s）表示。选用t检验进行统计学显著性分析。P<0.05为差异具有统计学意义。
2　结果
2.1　RB组织与瘤旁正常视网膜组织中MEG3的表达量　使用qRT-PCR检测RB组织与瘤旁正常视网膜组织中MEG3的表达水平。结果显示，MEG3在RB组织中的表达量是瘤旁正常视网膜组织的（0.69±0.11）倍（P=0.014），表明在RB细胞中MEG3处于低表达状态。
2.2　转染pcDNA-MEG3或siRNA-MEG3对RB细胞中MEG3表达量的影响　qRT-PCR检测结果显示，转染了pcDNA-MEG3的SO-RB50细胞与对照组比较，前者的MEG3表达量是后者的（28.31±3.79）倍(P=0.002)；在吉玛公司提供的三条MEG3特异性siRNA序列中选取抑制效率最高的一条进行研究，转染了此条siRNA-MEG3的HXO-RB44细胞与对照组比较，前者的MEG3表达量是后者的（0.38±0.04，P=0.004），表明MEG3能分别显著上调和下调RB细胞SO-RB50和HXO-RB44中MEG3的表达水平，是研究MEG3功能的有效工具。
2.3　上调、下调MEG3的表达对SO-RB50和HXO-RB44细胞凋亡的影响　将pcDNA-MEG3载体或siRNA-MEG3转染至SO-RB50或HXO-RB44细胞中，48 h后进行流式细胞仪检测分析SO-RB50和HXO-RB44细胞的凋亡情况。流式细胞仪检测结果显示，转染了pcDNA-MEG3载体的SO-RB50细胞与阴性对照组相比，早期凋亡细胞比例明显增加（P<0.05，图1）；与之相反，HXO-RB44细胞转染了siRNA-MEG3后，早期凋亡细胞比例与阴性对照组相比明显减少，差异有统计学意义（P<0.05，图2）。说明MEG3能诱导RB细胞凋亡。
2.4　MEG3对P53蛋白相对表达水平的影响　用pcDNA-MEG3载体或siRNA-MEG3转染至SO-RB50或HXO-RB44细胞作用72 h后，Western blot检测P53蛋白的相对表达水平。过表达MEG3后，SO-RB50细胞P53蛋白相对表达水平较阴性对照组显著升高，差异有统计学意义（P<0.05，图3）；而HXO-RB44细胞的P53蛋白的相对表达量明显低于阴性对照组（P<0.05，图3）。说明MEG3 在RB中可能通过激活P53蛋白的表达而发挥作用。





3　讨论
    lncRNA是近年基因研究领域的热点，其可通过影响各种miRNA及蛋白的表达而发挥促癌或抑癌作用。MEG3是一个具有抑制肿瘤功能的lncRNA，在多种肿瘤中表达下调。我们既往研究发现其在RB细胞中低表达，且可通过促进视网膜母细胞瘤蛋白表达而发挥其抑制RB细胞增殖的作用［12］。为进一步研究其在RB组织中的表达，本研究通过qRT-PCR检测21例RB组织及瘤旁正常视网膜组织标本中MEG3的表达水平，结果显示RB组织中MEG3表达量显著低于瘤旁正常视网膜组织，与既往在RB细胞中的研究结果相似，再次提示MEG3失活可能参与了RB的形成。
    ZHANG等［4］发现在宫颈癌细胞中高表达MEG3可增加细胞凋亡，LU等［10］发现MEG3的过表达可诱导非小细胞肺癌细胞凋亡。为了进一步研究MEG3在RB的发生发展中是否发挥了促进细胞凋亡的作用，我们进行了流式细胞仪检测，结果发现，转染了pcDNA-MEG3的SO-RB50细胞凋亡速度显著高于阴性对照组，转染siRNA-MEG3的HXO-RB44细胞凋亡速度显著低于阴性对照组。以上实验结果显示在RB细胞中上调MEG3表达能诱导细胞凋亡，干扰MEG3表达能抑制细胞凋亡，进一步证实了MEG3可通过诱导细胞凋亡参与RB的发生发展。以上研究结果与MEG3在其他肿瘤中的研究结论基本一致。
    ZHOU等［9］在结肠癌细胞和骨肉瘤细胞、LU等［10］在非小细胞肺癌细胞系、SUN等［11］在胃癌细胞系中重新表达MEG3，均观察到P53蛋白表达量上升，提示MEG3可能通过P53蛋白抑制结肠癌细胞、骨肉瘤、非小细胞肺癌细胞及胃癌细胞的增殖，并促进其凋亡。P53蛋白可诱导细胞周期停滞及凋亡，并且能够介导其他抑癌因子发挥作用，在抑制肿瘤过程中起着核心作用［9］。此外有研究显示，RB的发生发展与P53基因密切相关［13］。BRENNAN等［14］通过在裸鼠玻璃体内注射RB细胞后发现，MDM2/MDMX的拮抗剂nutlin-3a能重新激活P53通路，增加RB细胞的凋亡。因此我们猜想MEG3在RB中也可能通过促进P53蛋白表达而诱导细胞凋亡，为此我们在随后的实验中进行了Western blot检测。结果显示转染了pcDNA-MEG3的SO-RB50细胞P53蛋白表达水平明显增高，转染了siRNA-MEG3的HXO-RB44细胞P53蛋白表达水平明显降低。以上实验结果表明，MEG3在RB细胞中可能通过激活P53蛋白的表达而发挥作用。
    综上所述，本研究发现MEG3在RB组织中低表达，且可能通过激活P53蛋白的表达而发挥其诱导肿瘤细胞凋亡的作用，有望成为RB新的生物学治疗靶点，但其发挥作用的具体机制尚未完全明了，有待进一步研究。