《眼科新进展》  2017年3期 210-214   出版日期：2017-03-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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针刺对干眼兔泪腺形态学及泪腺上皮细胞凋亡相关基因蛋白表达的影响


    干眼是临床常见的眼表疾病，是指任何原因引起的泪液质或量的异常，或动力学异常导致的泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适和（或）眼表组织损害的多种疾病的总称^［1］。泪腺受副交感神经支配，当神经反射通路出现问题，泪液分泌减少，则形成水液缺乏性干眼。目前干眼的治疗仍是一大难题，临床采用的措施主要有药物治疗、手术治疗、中医疗法等，其中针刺治疗干眼的临床疗效得到广泛认可，但对其作用机制的研究仍旧不够深入。本文在氢溴酸东莨菪碱诱导兔干眼模型的基础上，进行针刺干预，以期深入探讨针刺对此类干眼模型的作用机制，为临床针刺治疗干眼提供强有力的理论依据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验动物及分组　选择健康新西兰白兔18只（南京青龙山动物养殖场，许可证号：SCXK-苏2012-0008），雌雄各半，月龄3～4个月，体质量1.5～2.0 kg，裂隙灯、检眼镜检查眼前节及眼底无异常，泪液分泌试验（Schirmer Ⅰ test，SⅠt）≥10 mm。饲养于12 h光照/12 h黑暗的环境中，自由摄食和饮水。随机分为空白组、模型组和针刺组，每组各6只。空白组不作任何处理，模型组和针刺组颈部皮下注射氢溴酸东莨菪碱注射剂，造模成功后针刺组进行针刺治疗。实验遵循国家实验动物管理保护条例。
1.1.2　实验仪器与试剂　氢溴酸东莨菪碱注射剂（广州白云山明兴制药有限公司）；Schirmer试纸（天津晶明新技术开发有限公司，批号：20140505）；华佗牌一次性无菌针灸针（苏州医疗器械厂，批号：140314）；WQ1002韩氏电针治疗仪；山羊血清蛋白封闭液（BSA 封闭液）、 山羊抗兔凋亡相关因子（factor-related apoptosis，Fas） 及其配体（FasL）多抗、Bax及Bcl-2多抗（均由福州迈新生物公司提供）；戊二醛、甲醛溶液、PBS缓冲液、多聚甲醛、二甲苯等。
1.2　方法
1.2.1　兔干眼模型的制备　取模型组和针刺组健康新西兰白兔各6只，颈部皮下注射氢溴酸东莨菪碱，每天4次（8∶00、11∶00、14∶00及17∶00），每次2 mg·kg^-1，直至实验结束共24 d。
1.2.2　针刺方法　从实验第11天开始针刺。选取穴位：双睛明、攒竹、丝竹空、瞳子髎、太阳，共5组10个穴位^［2］，如图1。睛明穴进针时推开眼球针尖向内下方斜刺入皮下3 mm，攒竹向下平刺3 mm，瞳子髎向外平刺3 mm，太阳穴直刺3 mm，均不行针，留针15 min。丝竹空透太阳，每侧电针正极接攒竹，无关电极接丝竹空，选用WQ1002韩氏电针治疗仪，采用疏密波，频率2 Hz/15 Hz，脉冲宽度0.5 ms，强度 1 mA（强度以针刺部位肌肉出现轻微抽动为准)，留针15 min，均双侧针刺，每天1次，连续治疗14 d。
1.3　观察指标及检测方法
1.3.1　SⅠt泪液检测　滤纸条一端折叠放入下睑内1/3结膜囊内，5 min后取出滤纸，从折叠处测量其湿润长度。



1.3.2　泪腺的形态学观察　兔颈动脉法处死后立即取一侧部分泪腺在甲醛溶液中固定24 h，石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜观察。部分组织在戊二醛中固定24 h后，透射电镜观察其超微结构。
1.3.3　免疫组织化学染色观察凋亡相关基因蛋白Bax/Bcl-2、Fas/Fasl的表达　兔颈动脉法处死后立即取另一侧部分泪腺，予以多聚甲醛固定，常规石蜡包埋。用PBS液冲洗3次，正常山羊血清封闭，室温孵育10 min。倾去血清，勿洗，滴加1∶50~1∶100比例稀释的一抗，37 ℃孵育1 h，PBS冲洗，5 min×3次。滴加即用型快速免疫组织化学Max Vision^TM试剂，37 ℃孵育10~15 min。PBS冲洗，5 min×3次，滴加新鲜配制的DAB 显色剂。自来水充分冲洗，苏木精复染，自来水冲洗返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。
    免疫组织化学标记：细胞膜和（或）细胞质中出现淡黄色至棕黄色细颗粒，着色高于背景底色为阳性。染色强度评分标准：根据切片随机抽取30个低倍视野（100倍）计算平均阳性细胞数，结果分4级:阳性细胞数≤25%为阴性（-）；阳性细胞数在>25%~50%为弱阳性（+）；阳性细胞数在>50%~75%为阳性（++）；阳性细胞数＞75%为强阳性（+++）。阴性、弱阳性、阳性、强阳性分别记 0、1、 2、3分^［3-4］。
1.3.4　观察时间　3组均在实验第0、11、17、24天检查SⅠt，保留Schirmer试纸，检测时间与上一次针刺时间间隔12 h以上，均在同一时段检测。实验第24天采用兔颈动脉法处死3组动物，立即取一侧泪腺进行形态学观察，另一侧泪腺进行免疫组织化学检测。所有实验动物给药、针刺、泪液检查及处死取材均由同一人在同一环境下完成。
1.4　统计学分析　所有数据经SPSS 18.0统计软件处理，计量资料采用均值±标准差（±s）表示，泪液量采用重复测量方差分析，Bax/Bcl-2、Fas/Fasl采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　SⅠt　各组各时段泪液分泌量结果见表1。同时段针刺组与模型组相比，在针刺第4、7、14天时，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）；在针刺第14天时，针刺组与实验前相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。



2.2　泪腺形态学观察
2.2.1　各组泪腺形态学的光镜结果　空白组中泪腺上皮细胞大小均匀，胞浆丰富，排列紧密；模型组泪腺上皮细胞萎缩，细胞内物质较少，在某些区域可见到炎症细胞；针刺组上皮细胞扩张，胞浆丰富，无淋巴细胞（图2）。



2.2.2　各组泪腺形态学的电镜改变　空白组中泪腺上皮细胞胞浆丰富，排列紧密，微绒毛排列有序。模型组上皮细胞萎缩，微绒毛稀疏，排列紊乱，内质网减少，呈现疏松状态。针刺组接近空白组（图3）。



2.3　凋亡相关基因蛋白Bax/Bcl-2、Fas/FasL在泪腺中的表达
2.3.1　Bax和Bcl-2免疫组织化学半定量测定结果　各组行半定量分析，结果如表2所示，与模型组比较，针刺组泪腺导管及腺泡上皮细胞中Bax的阳性细胞半定量评分值明显低，差异有统计学意义（P＜0.05）；Bcl-2的阳性细胞半定量评分值亦低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与空白组相比，针刺组Bax、Bcl-2评分值差异均无统计学意义（均为P＞0.05）。
    针刺组泪腺导管及腺泡上皮细胞中可见少量Bax阳性染色的淡黄色至棕黄色细颗粒细胞；模型组可见腺泡萎缩及大量的淡黄色至棕黄色细颗粒细胞。针刺组Bcl-2阳性染色的淡黄色至棕黄色细颗粒细胞数与模型组差异无统计学意义（P>0.05，图4、图5）。
2.3.2　Fas和FasL免疫组织化学半定量测定结果　各组行半定量分析，结果如表3所示，与模型组比较，针刺组的泪腺导管及腺泡上皮细胞中Fas、FasL的阳性细胞半定量评分值明显低，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。与空白组相比，针刺组Fas、FasL评分值差异均无统计学意义 (均为P＞0.05)。
    针刺组的泪腺导管及腺泡上皮细胞中可见少量Fas、FasL阳性染色淡黄色至棕黄色细颗粒细胞；模型组可见腺泡萎缩及大量Fas、FasL阳性染色淡黄色至棕黄色细颗粒细胞以及部分炎症细胞浸润（图6、图7）。









3　讨论
    由泪腺、眼表（角膜、结膜）和眼睑，以及连接它们的感觉与运动神经构成了一个整体功能单位，共同调控泪液分泌和泪膜形成，维护眼表的健康，其中任一环节受损均可导致泪膜完整性和功能破坏，从而形成干眼。用于动物实验的水液缺乏性干眼模型多通过局部滴用硫酸阿托品滴眼液或皮下注射氢溴酸东莨菪碱来制备，二者均为胆碱能受体阻滞剂，与阿托品中枢作用强的特点不同的是，氢溴酸东莨菪碱抗胆碱作用在外周作用较强，且已有研究将二者制作的干眼模型进行对比，提出东莨菪碱制备的干眼模型更稳定长久^［5］。东莨菪碱通过抑制乙酰胆碱与受体结合，产生抗胆碱作用，从而抑制副交感神经，导致泪液分泌减少，形成水液缺乏性干眼。仇晶晶等^［6］认为，氢溴酸东莨菪碱引起的干眼以泪液分泌减少为主，同时伴免疫性炎症和细胞凋亡等多因素共同参与。
    细胞凋亡属细胞的主动死亡，当细胞受到外界某些因素作用时，其代谢与调节过程会发生改变，出现DNA断裂等变化，从而发生凋亡^［7］。Fas又称CD95，是细胞凋亡基因受体，Fas一旦和配体FasL结合，可通过Fas分子启动致死性信号转导，最终引起细胞一系列特征性变化，使细胞凋亡^［8］。Bcl-2家族是在细胞凋亡中有重要作用的一类蛋白质，Bcl-2和Bax分别是Bcl-2家族中最具代表性的抑制凋亡和促进凋亡基因，并且Bax是Bcl-2活性的主要调控因子^［9］。细胞凋亡是干眼发病的重要机制，有学者在狗干眼症模型的眼表组织中发现凋亡相关标志物Fas、FasL的表达增强，凋亡抑制因子Bcl-2表达下降^［10］。也有研究提出去势大鼠干眼模型的泪腺组织中Bcl-2 mRNA表达显著降低，Bax mRNA表达显著提高，并认为Bcl-2 mRNA上调和Bax mRNA下调可能是干眼症中抑制泪腺细胞凋亡的重要机制之一^［11］。张月梅等^［7］通过去势雄兔制作干眼模型，并进行针刺干预，研究提出针刺可上调此干眼模型泪腺上皮细胞中Fas、FasL的表达。而MANGANELLI 等^［12］提出凋亡率还取决于凋亡抑制因子Bcl-2和凋亡诱导因子Bax之间的平衡和Fas、FasL的相互作用。目前尚缺乏有关针刺对水液缺乏性干眼兔模型泪腺组织中Bax/Bcl-2、Fas/FasL表达影响的相关研究。
    本实验结果显示，在针刺第4、7、14天，针刺组的泪液量与模型组相比，差异均有统计学意义。同时在针刺第14天时，与实验前相比，针刺组差异已无统计学意义，说明针刺至第14天时，已能对东莨菪碱制备的干眼产生良好的干预作用，使泪液分泌得到基本恢复。其次，光镜下泪腺形态学观察结果显示，模型组的泪腺上皮细胞萎缩，细胞内物质较少，且在某些区域可以见到炎症细胞，说明腺细胞代谢功能低下；而针刺组中泪腺上皮细胞扩张，胞浆丰富，无淋巴细胞，说明泪腺细胞代谢功能良好。电镜下模型组泪腺上皮细胞萎缩，微绒毛稀疏，排列紊乱，内质网减少，呈现疏松状态，而针刺组与空白组接近，泪腺上皮细胞胞浆丰富，排列紧密，微绒毛排列有序。
    针刺组泪腺细胞凋亡相关基因蛋白Bax、Fas及FasL阳性表达的细胞数明显低于模型组；且针刺组Bax、Bcl-2、Fas、FasL表达与空白组的差异均无统计学意义。实验表明，针刺能有效干预水液缺乏性干眼兔模型，其机理可能与针刺能抑制干眼兔泪腺组织的细胞凋亡及腺体萎缩，促进泪腺代谢，增加泪液分泌有关。