《眼科新进展》  2017年2期 184-188   出版日期：2017-02-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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TGF-β在角膜损伤修复中的时间和空间分布


    角膜损伤修复是一系列的动态级联反应过程，通常包括角膜基质细胞及肌成纤维细胞的激活、增生、分化，细胞因子的释放，细胞外基质的合成和降解等，此过程是由多种细胞和细胞因子在时间和空间上高度协调而完成的^［1］。转化生长因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）参与角膜损伤修复过程中角膜细胞的增殖、迁移，肌成纤维细胞的分化，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的生成等重要过程，被认为是角膜损伤修复过程中最重要的调控因子，同时也是导致角膜纤维化疾病的主要细胞因子^［2-3］。目前研究认为，TGF-β在哺乳动物中的3个亚型（TGF-β₁、TGF-β₂、TGF-β₃）在角膜损伤修复中分别具有不同的作用^［4］。
1　TGF-β的生物学作用    TGF-β超家族是一个在结构、功能、命名、受体类型、同源序列和信号转导通路等方面都极为复杂的蛋白质组。该超家族由具有多种功能的细胞因子组成，包括3个异构体、5个活化素、苗勒管抑制物及8个（或更多）编码在不同基因中的骨形态发生蛋白^［5-6］。TGF-β是TGF-β超家族中一种能够调节体内多种器官和组织中关键细胞生物过程的多效、多功能的细胞因子，在哺乳动物有3个亚型，即TGF-β₁、TGF-β₂、TGF-β₃。这3个亚型都是相对分子质量为25 000的同型二聚体蛋白，并拥有大部分氨基酸同源序列：TGF-β₁与TGF-β₂有75%的同源序列，与TGF-β₃有80%的同源序列，而TGF-β₂与TGF-β₃有接近80%的同源序列^［7］。    TGF-β参与体内许多重要的生理过程，如细胞增殖、迁移、分化、凋亡和ECM生成，调控细胞周期进程、程序化细胞死亡、免疫耐受、血细胞生成、骨形成等；能刺激胶原合成及一些关键蛋白（黏合素、纤维连接蛋白、血小板反应蛋白、蛋白多糖、金属蛋白酶-1组织抑制剂、纤溶酶原激活物抑制剂-1等）的产生；还能以亚型依赖方式保护神经元；同时也与多种疾病和器官病理过程有关，如自身免疫疾病，肿瘤形成，炎症，动脉粥样硬化，肺、肝、肾、皮肤的纤维化等。在许多情况下TGF-β还具有双向功能，即根据所处环境不同可激发或抑制同一细胞反应过程，例如在肿瘤形成过程中，TGF-β早期抑制肿瘤细胞的有丝分裂，而晚期则促进肿瘤血管再生及肿瘤转移^［8-15］。在角膜损伤修复过程中，TGF-β能抑制角膜上皮细胞增殖、激活肌成纤维细胞、促进ECM合成，从而使角膜损伤愈合，但TGF-β过度表达又会导致角膜瘢痕的形成^［16］。而TGF-β的3个亚型在角膜损伤修复过程中具有不同的作用。
1.1　TGF-β₁与TGF-β₂促进角膜纤维化　角膜损伤修复时，TGF-β₁在三个亚型中早期表现最活跃，能够延迟上皮再生，激活角膜基质细胞，参与和细胞迁移有关的早期角膜损伤修复阶段，并促进肌成纤维细胞的分化与增殖^［17-19］。而被激活的肌成纤维细胞又可同时自分泌TGF-β₁，从而使纤维化反应一旦开始便迅速进行，大量ECM产生并杂乱沉积于基质层，导致角膜瘢痕的形成^［20］。    TGF-β₂在角膜发育、维持内环境稳定、促进角膜修复方面具有重要作用^［21］。角膜损伤后，TGF-β₂趋化成纤维细胞至损伤局部，也参与肌成纤维细胞的转化、增殖和分层；TGF-β₂还被认为是上皮细胞产生的主要激发纤维化过程的因子，是角膜纤维化反应的主要调节者，并被大量表达，也是最主要的角膜损伤修复的启动因子^［22］。TGF-β₂还能通过调节p38MAPK信号转导通路来间接调节角膜损伤修复中上皮细胞的增殖^［23］。
1.2　TGF-β₃抑制角膜瘢痕形成　在角膜损伤修复中，TGF-β₃能抑制基质细胞增殖并终止瘢痕继续形成^{［17，24］}。在 ZIESKE带领的团队^［25-26］所进行的实验中，TGF-β₃可促进新生的角膜基质细胞高度有序排列，不形成瘢痕，而TGF-β₁和TGF-β₂则导致角膜纤维化修复；其团队后来的实验证明，用TGF-β₃可逆转TGF-β₁造成的角膜纤维化。并且，用TGF-β₃处理体外培养的角膜细胞，还可促进角膜上皮细胞增生^［27］。HUH等^［28］认为TGF-β₃可能刺激未损伤区域的上皮细胞增殖，但并不参与损伤区域再生上皮细胞的增殖。
2　TGF-β的分布    TGF-β广泛存在于各种正常细胞及转化细胞中，如血小板、单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等，参与几乎所有器官（如肝脏、肺、肾、心脏等）及组织（如角膜、椎间盘、皮肤等）的纤维化过程^［29］。在角膜损伤修复过程中，TGF-β在时间与空间分布上与正常情况时存在很大差异。
2.1　TGF-β在正常角膜的分布　眼部多种细胞，如结膜上皮细胞、晶状体上皮细胞、视网膜色素上皮细胞等都表达TGF-β；角膜及许多其他眼前部组织，如泪膜、角膜缘和结膜也表达不同的TGF-β亚型及其受体^［30-31］。TGF-β₁和TGF-β₂都在泪膜中存在，且TGF-β₁是泪膜中的主要亚型；上皮基底膜（basement membrane，BM）中有低浓度的TGF-β₁存在，大部分上皮基底细胞和角膜内皮细胞胞浆中都有显著的TGF-β₂表达，同时上皮基底细胞的胞浆中还有低浓度的TGF-β₃表达；而房水中则含有高浓度的TGF-β₂，在角膜内皮损伤修复时可促进内皮细胞迁移^{［23，27，32］}。
2.2　TGF-β在角膜损伤修复过程中的动态分布
2.2.1　BM在角膜损伤修复过程中的重要作用　角膜上皮细胞与其下的角膜基质层由BM分开，BM有四种最主要的成分：胶原蛋白、黏聚蛋白、巢蛋白及硫酸肝素聚糖^［33］。完整的BM能对其两侧的弥散性细胞因子起到选择性通透作用，是上皮层与基质层的分子屏障^［34］。WILSON^［35］认为，BM通过其屏障作用阻止上皮细胞产生的TGF-β穿入基质层来调节肌成纤维细胞的发育，从而影响角膜瘢痕的形成。准分子激光角膜切削术（photorefractive keratectomy，PRK）后，低度近视者BM恢复较早，肌成纤维细胞的凋亡较生成多，故角膜损伤愈合后极少的肌成纤维细胞剩余来产生ECM；而高度近视者术后伤口较深，BM修复较慢，肌成纤维细胞生成较凋亡多，最后剩余较多肌成纤维细胞，产生ECM也相应增多。这也是PRK术后低度近视者与高度近视者角膜差异性恢复的原因所在。    当BM损伤时，上皮细胞产生的细胞因子如TGF-β就会被释放入基质层^［36］，刺激角膜基质细胞转化为活性的成纤维细胞并迁移到损伤区域。这些新产生的成纤维细胞一旦被激活便参与一系列自分泌与旁分泌通路来维持自身活性，并合成与正常基质成分不同的新的ECM。之后成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，并表达α-平滑肌蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA），使细胞回缩，伤口愈合。同时肌成纤维细胞也产生与正常基质成分不同的ECM。新合成的ECM成分及这些成分紊乱的排列方式，导致角膜瘢痕的形成^{［22，37］}。
2.2.2　BM完整时的角膜损伤修复中TGF-β的时空分布　对于BM完整时的角膜损伤修复相关的临床现象在21世纪初期即被发现。最经典的临床现象是PRK及准分子激光原位角膜磨镶术（laser in situ keratectomy，LASIK）相比较：前者较后者角膜混浊（Haze）发生率较高。LASIK手术上皮瓣边缘会暂时性存在肌成纤维细胞及基质重塑，但上皮瓣下并不出现显著的基质层重塑，一般无Haze发生^［38］。    早期的研究认为角膜基质的纤维化激活受到角膜上皮的调控。2001年，NAKAMURA等^［39］对兔子行PRK及LASIK手术，术后应用免疫荧光化学法检测角膜上皮下基质层的α-SMA及Ⅲ型胶原纤维（collagen Ⅲ，COLⅢ），发现接受PRK手术的兔角膜及LASIK手术的角膜瓣角膜上皮受损处相应的角膜基质α-SMA及COLⅢ表达显著增加，提示保留完整的角膜上皮对于减少角膜基质肌成纤维细胞分化及术后Haze的发生具有重要作用。    2009年，这一现象被HUH等^［27］在分子机制上详细阐明。该研究用小鸡角膜制造角膜中央伤口，行上皮清创术后保留BM的完整性，分别在伤后12 h、48 h、7 d、14 d用免疫荧光化学方法检测TGF-β三个亚型的分布情况（伤口在48 h愈合）。TGF-β₁在伤后48 h内在损伤区域修复的角膜上皮中高度表达，7 d后下降，持续至14 d；但早期修复时在成纤维细胞中表达很微弱，表明BM的完整性对TGF-β₁释放入基质层来说有屏障功能，从而无法激发角膜纤维化反应。TGF-β₂的分布特点为：（1）出现时间更早（伤后12 h）；（2）出现在迁移和增殖的上皮细胞、活性成纤维细胞及内皮细胞中。该研究观察到：上皮下的基质前部损伤是由损伤边缘的活性成纤维细胞迁移而生成的，并没有明显的细胞增殖，且这些成纤维细胞在损伤修复后又恢复至角膜基质细胞。由此看来，TGF-β₂可能使基质细胞转化为成纤维细胞，而损伤修复后，TGF-β₂消失，成纤维细胞又转化为基质细胞。表明TGF-β₂发挥多种作用，且在再生修复中发挥关键作用。TGF-β₃在未损伤区域和再生的上皮基底细胞中表达，并不在迁移的上皮细胞、基质细胞或内皮细胞中表达。该研究应用TGF-β₃刺激体外培养的鸡角膜上皮细胞发现其可以促进鸡角膜上皮生长。这与鸡角膜外伤模型中TGF-β₃的分布方式吻合。
2.2.3　BM缺损时的角膜损伤修复中TGF-β的时空分布　正常情况下，BM控制着角膜上皮来源的生长因子与细胞因子（如TGF-β₁与血小板衍生生长因子）对基质层的有效性，或者角膜基质来源的生长因子（如角质细胞生长因子）对上皮层的有效性。BM是角膜创伤修复过程中角膜上皮与基质相互作用的重要屏障。BM损伤使得基质层与上皮层的细胞因子相互渗透发挥作用。角膜基质细胞在这些细胞因子作用下凋亡、转化为肌成纤维细胞^［40-41］。而BM再生后，基质层中生长因子和细胞因子减少甚至消失导致肌成纤维细胞凋亡。上皮BM的完整性在损伤时常被破坏，会导致角膜损伤修复延迟。不同的角膜损伤动物模型所造成的损伤深度及广度、创伤愈合时间不一样，所得TGF-β的时空分布结果也不一样。    TULI^［42］对大鼠角膜行PRK，手术范围为角膜中央直径3 mm。手术先切除上皮层（28~34 μm），再切除基质层（20 μm），总厚度为48~54 μm，手术区域BM被切除。术后0 d、7 d、21 d用免疫荧光化学法定位后发现，TGF-β₁和TGF-β₂均定位于未损伤角膜及修复角膜的上皮基底细胞中。TGF-β₂在伤后7 d在角膜上皮基底细胞高表达。该研究未发现基质层有TGF-β₁和TGF-β₂的表达，估计与手术切削深度较浅有关。    而该研究领域应用最多的是角膜全层外伤经典动物模型：对小鼠或小鸡角膜中央直径1 mm范围进行穿透性切除，约15 min后以纤维蛋白块封闭缺损区，进行前房重建。FINI等^［22］和HUH等^［28］分别以小鼠和小鸡为受试对象，应用该动物模型检测TGF-β三个亚型在角膜创伤修复中的时空分布。两个研究组所得研究结果相仿。由于BM受损，伤后3 d封闭角膜切除区的纤维蛋白块出现TGF-β₁及TGF-β₂；伤后7 d，TGF-β₁扩展至伤口外的角膜基质后部及角膜内皮细胞附近区域，而TGF-β₂在受损区域表达达到高峰；伤后14 d，角膜中央TGF-β₁消失，而TGF-β₂仍有表达；伤后24 d，角膜基质未能检测到TGF-β₂，而内皮仍有较强的TGF-β₁表达。    TGF-β₁的时空分布特点提示其表达受损伤修复状态的调节，即损伤修复前高表达，修复后低表达；且只调节与细胞迁移有关的早期损伤修复阶段。TGF-β₂出现在损伤上皮细胞中，表明其可能刺激损伤区域再生上皮的增殖和分层；成纤维细胞迁移到损伤区，并快速变为肌成纤维细胞，后者分泌TGF-β₂，又由于该研究中TGF-β₂染色与α-SMA染色一致，故推测TGF-β₂激发肌成纤维细胞表型的出现，在肌成纤维细胞转化中发挥重要作用。TGF-β₃仅表达于伤后1 d及3 d上皮基底细胞胞浆中，始终未出现在基质层和内皮层，表明TGF-β₃不参与这两层的损伤修复。
3　TGF-β三亚型在角膜损伤修复过程中的相互联系在角膜损伤修复时，无论BM是否完整，TGF-β₁都是首先发生反应的TGF-β亚型，调控损伤修复早期的细胞迁移，并能激发TGF-β的信号传递，还刺激TGF-β₂的自分泌循环，从而使迁移至基质的细胞TGF-β₂表达上调。早期的TGF-β₁沉积在损伤区域对初期的瘢痕形成来说至关重要，而之后胶原基质的不断重塑则是TGF-β₁与TGF-β₂协同作用的结果。TGF-β₂则主要负责上皮层与内皮层细胞的迁移和增殖，并促进肌成纤维细胞的转化。TGF-β₃则在损伤修复后期大量表达，促进上皮细胞增殖与分层^［28］。    虽然体内研究表明TGF-β₃不参与角膜基质层与内皮层的损伤修复，但体外实验却证明TGF-β₃能逆转TGF-β₁引起的角膜纤维化^［26］。而且TGF-β₃主导胎儿损伤修复，TGF-β₁则是成人损伤修复的主要亚型。曾经有研究将外源性TGF-β₁加入胎儿损伤部位，从而将无瘢痕修复转化为瘢痕修复，这表明无瘢痕修复也许与TGF-β₁和TGF-β₃的比值有关^［43-44］。
4　展望    角膜瘢痕已成为全球三大致盲疾病之一，研究TGF-β在角膜损伤修复中的时间、空间变化对于早期控制纤维化反应从而减少角膜瘢痕形成具有重大意义。目前来看，角膜损伤修复最早期的事件可能对预后有着重要影响，因此，如能清楚了解TGF-β亚型的时空分布情况，并合理应用针对TGF-β亚型的抑制因素，就能有效控制角膜损伤后成纤维细胞的过度增生及新生胶原的合成，以减少角膜损伤后角膜瘢痕的发生。