《眼科新进展》  2017年2期 101-105   出版日期：2017-02-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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高强度光照损伤致TgAPPswePS1转基因鼠脉络膜新生血管形成


    阿尔茨海默病（Alzheimer’s dieasea，AD）与老年性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）都是年龄相关的退行性疾病，β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）是AD关键致病因子^［1-2］；研究者们发现AD患者存在视功能障碍及视网膜结构改变^［3-4］，但不存在AMD的特征性脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)性改变，考虑到AMD疾病中的高危因素如光损伤，那么给予AD模型鼠AMD高危因素刺激是否会导致AMD相关的特征性改变？为此，本实验选择AD转基因鼠TgAPPswePS1为研究对象，探讨在光照损伤作用下TgAPPswePS1转基因鼠视网膜病理变化，为AMD的CNV发生机制研究提供新的模型。
1　材料与方法
1.1　实验动物　TgAPPswePS1 小鼠［B6C3-Tg（APPswe，PSEN1dE9） 85Dbo/J（Tg） ］由Jackson Laboratory实验室（Bar Harbor，ME，美国）引进并繁殖。本研究对所有转基因鼠都进行了基因型鉴定。选择6个月大小APPswe（+）与PSEN1dE9（+）的AD转基因鼠20只为研究对象。
1.2　实验仪器与试剂　切片机Cm1850-1-1（德国Leica公司），蔡司体式显微镜（德国Zeiss公司），荧光显微镜（德国蔡司Axioylan2），共聚焦显微镜（德国蔡司LSM510MEH）。Aβ抗体（美国新泽西州Covance公司），新生血管生长因子（武汉Beyotime 公司），甲苯胺蓝染色试剂、40 g·L^-1多聚甲醛（美国Sigma公司），抗体封闭液、抗体稀释液（武汉Boster公司），抗荧光淬灭封片剂H-1200（美国Vector Labs公司），DAPI（美国Invitrogen公司），复方托吡卡胺（沈阳兴齐制药公司）。
1.3　方法
1.3.1　光照处理　在SPF级饲养环境里进行本研究。研究所需的食水均经高压灭菌，每天换垫料；随机选取12只小鼠为实验组，均应用动物光损伤装置（专利ZL201620227064.X）给予光照干预，设光照度为10 000 lux，每天光照12 h，光照处理6个月，在光照过程中保持小鼠瞳孔散大；剩余8只无光照小鼠为对照组。
1.3.2　石蜡切片和免疫组织化学染色　光照6个月（即小鼠鼠龄为12个月）时终止实验。对照组和实验组各随机取4只小鼠，100 g·L^-1水合氯醛（0.05 mL·g^-1）腹腔注射麻醉，预冷PBS心脏灌注后取眼球，40 g·L^-1多聚甲醛常温下固定24 h，置于 4 ℃ 储存备用。进行石蜡切片：常规漂洗后，梯度乙醇脱水（体积分数50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇各2 h）；然后二甲苯浸泡45 min；在熔点为52~56 ℃ 的软蜡中浸泡15 min×2次；浸蜡的组织块放入包埋框中，硬蜡（熔点为60~62 ℃）包埋，蜡块备用。切片机连续切片，厚约4 μm，贴附于载玻片上，常规石蜡切片脱腊至水：二甲苯洗10 min×2次，然后体积分数100％、100％、95％、95%、90%、80%、70％乙醇各2 min；双蒸水泡片5 min，以保持最好细胞形态；切片再分别进行以下两种染色：（1）苏木精-伊红染色（HE染色）：苏木素染料中浸泡15 s；流水下冲片直至深紫色变为浅紫色；在体积分数1％的稀氨水-HCL中停留60 s，使苏木素着色区变为淡蓝色；流水冲片，双蒸水中浸泡5 min；5 g·L^-1伊红2~3 min染细胞浆，流水洗；（2）甲苯胺蓝染色：3 g·L^-1甲苯胺蓝溶液浸染（55 ℃保温箱）3 min，双蒸水清洗2~3次，在体积分数0.15％的盐酸乙醇中分色30 s，流水洗40 s。    两种染色后，常规依次经体积分数80%（1 min×2次）、95%（3 min×2次）、100%（5 min× 2次）乙醇脱水；二甲苯透明；中性树胶封片，显微镜下观察，并采集图像。
1.3.3　视网膜色素上皮铺片和免疫荧光化学检测　在光照6个月后，对剩余的4只对照组和8只实验组小鼠给予100 g·L^-1水合氯醛（0.05 mL·g^-1）小鼠腹腔注射麻醉后，将获得的眼球组织用40 g·L^-1多聚甲醛于常温下固定4 h，在蔡司体式显微镜下，沿角巩膜缘剪开眼球，去除眼前段（包括角膜、虹膜眼前段、晶状体），将眼杯呈放射状剪8刀至视盘处，分成8瓣，小心分离去除视网膜，保留视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞层，铺于玻片上，RPE铺片用PBS漂洗5 min×3次，抗体封闭液封闭45 min；一抗孵育：将组织切片于稀释的一抗溶液中4 ℃孵育过夜，其中一抗Aβ按照 1∶100比例稀释，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）按照1∶500比例稀释，PBS洗5 min×3次；二抗及DAPI室温孵育60 min，PBS洗8 min×3次；滴加含防荧光淬灭剂的封片剂，盖上盖玻片，封片，在共聚焦显微镜下观察并采集图像，并应用共聚焦Z轴立体观察技术（Z-stack）观察RPE铺片上相应荧光表达。
1.4　图像采集及数据获得　视网膜切片HE染色、甲苯胺蓝染色和RPE铺片免疫荧光采集图像都由同一人在相同实验条件下完成。Aβ和VEGF 铺片免疫反应强度：每组取6~8个眼球，在每个铺片上离视神经约500 μm处，400倍放大倍率下随机观察 4~6张切片，在Image Pro Plus5软件中统计Aβ、VEGF免疫反应强度。CNV发生率：每组统计发现CNV的眼球数，对每个眼球取经视盘非连续性切片3张，计数每张片子上的所有CNV数目，取平均值为各组CNV的发生率。
1.5　统计学分析　所有数值型实验数据均以均数±标准差表示（±s），组间均数两两比较采用SPSS 19.0软件中Student’t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2　结果
2.1　光照前后TgAPPswePS1鼠视网膜结构改变　对照组转基因鼠的视网膜各层结构无缺失，排列无明显紊乱：神经节细胞层结构清晰，内外核层排列无紊乱，内外丛状层及外节未见明显异常（图1A-B，图2A、E）。    光照6个月后，实验组视网膜切片经HE染色检查发现视网膜发生剧烈变化：视网膜厚度明显变薄（图1C），视网膜的改变主要体现在外核层（outer nuclear layer，ONL）与光感受器外节（out segment，OS），ONL明显变薄并且排列紊乱，甚至发现ONL仅剩下一两层结构，同时OS变短甚至消失，结构紊乱（图1D）。甲苯胺蓝染色发现实验组RPE存在明显改变：包括空泡样改变（图2B箭头），RPE细胞间的连接断裂（图2C箭头），RPE细胞内色素不均一，既有色素增生（图2C短箭头所示）又有色素脱失（图2D短箭头所示）与血管样组织（图1D，图2F-G）；出现的新生血管伴随RPE细胞增生迁移，血管样组织与RPE紧密相连并形成花蕾样外观（图2F短箭头），形成的血管样组织包含大量色素并形成管腔（图2G），可以观察到红细胞在管腔内，新生血管从脉络膜长入，并突破RPE层而进入内层视网膜结构（图1D，图2G）。统计CNV的发生率结果示，实验组CNV的发生率约为18.75%，全层视网膜切片上有1~2个新生血管组织结构。    在所有实验鼠光照前后，视网膜各层都没有发现Drusen或者黄白色沉积物存在。

2.2　Aβ与VEGF的表达　对照组仅见背景荧光表达。实验组光照6个月后可见Aβ在RPE铺片上存在表达（图3），且显示为强阳性反应（图3B）。不同于视网膜切片的单一二维结构，RPE铺片显示Aβ在RPE沉积的立体形态，包括多种形式：弥散型、点块状、斑块状存在（图3B、E）；通过Z-stack图像可以看出Aβ斑块聚集出现在RPE层，类似Drusen样沉积；但从位置角度来说，Aβ聚集斑块偏位于RPE下（图3E）。对Aβ表达量进行定量统计，发现免疫反应表达量较对照组（基数为1）增加（6.45±2.93）倍，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05；图3C）。    对照组RPE为单一细胞层，在铺片上RPE细胞核显示为近圆形。实验组DAPI染色后在RPE细胞层上发现较多的扁平型细胞核，这类细胞核完全不同于圆形RPE细胞的细胞核（图3E箭头），将扁平细胞核勾勒出来，形成条索样形态。进一步用VEGF特异染色检测RPE铺片，结果发现VEGF在对照组呈阴性表达，而在实验组呈阳性表达，可见细胞浆内弥散性表达与沿血管壁的阳性染色，在RPE铺片上发现VEGF阳性表达位置同扁平的细胞核重叠，形成明显的血管样结构（图3E）；对VEGF表达进行定量，实验组表达量较对照组增加（6.59±1.14）倍，与对照组（基数为1）比较差异有统计学意义（P<0.05）。    用Z-stack检测血管组织与Aβ的关系，在图3E、F中，Aβ红色与VEGF绿色存在重叠，形成黄色管腔，Aβ与VEGF存在同染共表达。


3　讨论
3.1　光照损伤下的AD转基因鼠视网膜结构改变　许多研究都证实了异常光照损伤是许多视网膜疾病的重要影响因素^［5-6］，光照损伤尤其可以引起视网膜炎症与RPE损伤^［7-8］。本研究发现光照损伤导致视网膜外侧结构尤其是OS和ONL明显改变，同已有的研究报道基本一致^{［5，9-10］}，但本研究中个别小鼠里发现ONL仅剩下一两层结构，OS变短甚至消失，如此严重损伤与本研究设定的高强度光照存在一定的关联性；考虑到既往研究报道AD模型鼠视网膜里的Aβ沉积本身就对视网膜产生毒性作用^［11］，所以可能是AD模型鼠的协同作用加重了光照因素对视网膜结构的破坏，但是具体在哪个环节起作用，仍有待进一步研究。
3.2　光照致AD转基因鼠CNV形成　本研究发现，AD转基因鼠经过高强度光照损伤后，在视网膜切片上存在新生血管，根据新生血管的位置、形态和结构以及细胞核形态推断为CNV。虽然近年来许多实验报道AMD与AD可能存在相关性，但是目前仍没有直接证据证明AD与AMD直接相关^{［4，12-13］}，也没有在AD模型上发现CNV^［14］，而本实验第一次报道了给予AD转基因小鼠强光损伤导致CNV的发生，具体的原因分析为：（1）有研究报道AD患者脑部的VEGF表达增加引起新生血管化性病变^［15］，而本研究也发现VEGF的高强度表达，这些结果强烈提示光照损伤AD转基因鼠引起CNV的发生同VEGF的表达增加有关系；（2）正常的RPE外屏障保证了视网膜结构的完整性，当RPE被破坏时，脉络膜血管突破RPE形成CNV就尤为容易^［16］，而本研究发现RPE细胞存在明显改变，如空泡样改变、RPE细胞间的连接断裂、RPE细胞色素增生及色素脱失等，所以本研究出现的CNV同RPE的结构破坏也存在一定的关系；（3）既往有研究报道，光照损伤可以引起正常的小鼠视网膜外层损伤，但是甚少在正常小鼠上发现新生血管的存在^［17］，考虑到除研究的对象不同外，在光照条件上也存在差异，故本研究结果提示高强度光照损伤也在新生血管形成中发挥作用；（4）有研究表明，Aβ沉积可引起RPE功能障碍^{［11，18］}，甚至影响血管生成环境而起到促进CNV形成的作用，而本研究中发现RPE铺片里存在大量的Aβ沉积，且倾向聚集在血管周围，所以本研究中发现的新生血管可能是在Aβ与VEGF等多方面作用下导致RPE功能破坏、屏障障碍的结果。
    综上所述，强光光照损伤TgAPPswePS1鼠后，视网膜存在明显变化，可发生CNV，提示AD转基因鼠在光照损伤下可以作为CNV的一种动物研究模型，为研究新生血管的发生机制提供新视角，为AMD疾病的治疗提供新思路。