《眼科新进展》  2017年1期 35-38   出版日期：2017-01-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
DNA甲基化转移酶（DNMT）3b基因的单核苷酸多态性与年龄相关性白内障


    年龄相关性白内障（age-related cataract,ARC）是全球第一位的致盲眼病［1］。尽管其确切的发病机制还未阐明，但晶状体上皮细胞DNA损伤后修复不全可能是其重要的发病机制之一。有研究表明，DNA甲基化调控DNA修复基因的表达可能与ARC的发生和发展有关［2-3］。人类DNA甲基化转移酶（DNA methyltransferases,DNMTs）基因包括3种类型：DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。该家族基因在催化基因组DNA甲基化过程中起到不同的重要功能。我们近期研究发现DNMT3b基因在ARC晶状体上皮细胞中的高表达导致DNA修复基因ERCC6低表达，从而导致其DNA修复能力减弱［4］。本研究旨在研究DNMT3b基因3个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNP）位点 （rs2424908、rs6119954、rs2424932）在江苏汉族人群中与ARC的关联。
1　资料与方法
1.1　研究对象及分组　ARC组选择江苏眼病研究阜宁县基地人群ARC确诊患者［5］(现场流行病调查工作于2010年6月至2011年5月进行)。晶状体混浊程度按LOCSⅢ分级系统进行分级［6］。入选标准：晶状体混浊；最佳矫正视力<0.5。排除标准：青光眼、高度近视、葡萄膜炎、外伤等原因引起的并发性白内障；双眼中任一眼为人工晶状体眼或无晶状体眼；患有糖尿病、肾脏疾病等全身性疾病以及视网膜疾病的ARC患者。对照组：同样来自上述同期江苏眼病研究阜宁县基地人群。入选标准：晶状体透明；最佳矫正视力≥0.5。排除标准：患有晶状体脱位、青光眼、葡萄膜炎等。两组均为本地汉族人群，四代内无血缘关系。家族中无ARC患者,在知情同意的情况下采集外周静脉血。病例组与对照组年龄(t=0.2,P=0.84)、性别 (χ2=0.039,P=0.97) 差异均无统计学意义（见表1），两组匹配，具有可比性。

1.2　方法
1.2.1　外周淋巴细胞基因组DNA制备　采用酚-氯仿-异戊醇法提取外周血白细胞基因组DNA。用紫外分光光度计（美国GE公司）测定DNA浓度及纯度(A260/A280为1.7～2.0)，符合扩增要求，DNA样本保存于-20 ℃。
1. 2.2　Tag SNP的选择　通过国际人类基因组单体型图计划 (HapMap)获得SNP位点基因型数据。运用HaploView软件分析并筛选出Tag SNP。遵循以下原则：（1）汉族人群中，稀有等位基因频率≥10%；（2）排除存在高度连锁不平衡性的突变位点（r 2≤0.8）；（3）具有文献报道的14个位点（rs6087990、rs742630、rs2424908、rs2424909、rs1883729、rs6119954、rs1569686、rs2424914、rs4911259、rs6119285、rs998382、rs992472、rs2235758、rs2424932）。排除高度连锁不平衡后，最终选择了3个SNP进行关联研究（见表2）。

1.2.3　SNP分型　采用 TaqMan-MGB荧光探针法进行SNP分型。体外扩增目的基因，反应体系25.0 μL，取1.0 μL DNA模板（10 ng），12.5 μL 2×PCR反应液，1.0 μL TaqMan-MGB探针及引物，余下用去离子水补足。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min;95 ℃" 变性30 s；60 ℃退火 30 s；72 ℃延伸 30 s，共 40个循环。使用实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）以双探针（VIC和FAM）荧光信号分别判定PCR产物中所含的野生位点和变异位点。每次检测设4个空白对照。
1.3　统计学方法　采用Stata 13.0软件进行统计学分析。两组结果的比较用t检验和χ2检验；组内SNP分布进行哈迪-温伯格平衡 (Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)检验；组间SNP分布的差别用Logistic回归分析，计算经年龄、性别调整的比值比（odds ratio,OR）。使用HaploView4.2软件进行连锁不平衡分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　HWE检验结果　除rs2424908外，对照组和ARC组的HWE检验结果说明两组DNMT3b基因SNP位点基因型实际频数与理论频数之间差异均无统计学意义（均为P>0.05），符合HWE定律。rs2424908位点排除出结果分析。
2.2　对照组和ARC组SNP等位基因频率分布　DNMT3b基因rs6119954位点，对照组稀有等位基因占33.57%，ARC组占32.77%，差异无统计学意义（P>0.05)。DNMT3b基因rs2424932位点，对照组稀有等位基因占7.72%，ARC组占8.40%，差异无统计学意义（P>0.05；见表3）。

2.3　对照组和ARC组SNP基因型频率分布　位点rs6119954 的AA与AG、AA与GG、AA与（AG+GG）的频率在对照组与ARC组间差异均无统计学意义(均为P>0.05)。位点rs2424932的AA与AG、AA与GG、AA与（AG+GG）的频率在对照组与ARC组间差异均无统计学意义(均为P>0.05；见表4）。

3　讨论
    ARC发病机制比较复杂，目前倾向于该病是遗传和环境相互作用所导致的一类疾病。其中内源性及外源性的氧化物质导致的DNA损伤被认为在ARC的发生发展中发挥了关键作用。而DNA修复基因则在DNA损伤后的晶状体上皮修复中起着重要的作用。遗传因素与ARC的关联一直是研究热点，尤其是功能区SNP对于基因表达的影响。同时，表观遗传学调控基因的表达不依赖DNA序列的改变，近年来在白内障发病机制中的研究也受到越来越多的关注［7-8］。我们的研究也发现，作为表观遗传学重要组成部分——DNA甲基化及组蛋白修饰，在ARC晶状体上皮细胞中参与调控DNA修复基因的表达［2-4］。
    DNMT3b基因在人类胚胎发育及调节基因的表达中起到重要的作用［9］，其定位于20号染色体q11.2，主要功能为催化DNA合成后重新获得甲基化。该基因的异常表达与很多疾病特别是肿瘤疾病相关［10-11］。我们近期研究发现，DNMT3b基因高表达导致ERCC6基因启动子区DNA高甲基化，并且导致其表达下调［2］。该基因的SNP与疾病的关联已有许多研究［12-14］。近年来更多研究集中在基因功能区的SNP特别是3’-UTR。
    本研究中我们选择的DNMT3b 3个SNP位点中，2个定位于内含子区（rs2424908、rs6119954），1个定位在3’-UTR区（rs2424932）。HE等［15］研究发现，在汉族人群中rs2424908位点CT/CC基因型的表达可降低前列腺癌的风险。DUAN等［16］的研究也发现在亚洲人群中该位点CT/CC基因型的表达可降低结肠癌的患病风险。ZHENG等［17］研究发现该位点CC基因型的表达可同样能降低急性淋巴细胞型白血病的患病风险。但由于该位点在本研究涉及的人群中不符合HWE定律，所以未能进一步研究该位点与ARC发病之间的关联。ZHANG等［18］研究发现，rs6119954位点G等位基因在精神分裂症患者中显著高于对照组，可能与该病的患病风险相关。但在本研究中未能发现该位点与ARC的发病有关联。部分定位在基因3’-UTR的SNP为microRNA潜在的结合位点，从而调控目标基因的表达，为近年来研究的热点。本研究中我们所选择的rs2424932即定位于DNMT3b的3’-UTR，预测该位点为潜在的microRNA目标核心序列。但在很多研究中并未发现该位点与相关疾病有关联［19-21］。在本研究中我们同样也未能发现该位点SNP与ARC有关联。
    本研究选择的研究对象尽管来源于流行病调查研究，避免了来自于医院患者所引起的选择偏倚，但是未能发现DNMT36基因的2个位点与ARC发病的关联，可能与本研究的样本量较少，且纳入研究的位点较少有关。我们后续将扩大样本量，同时选择该基因其他SNP位点研究，为ARC的发病机制的研究提供新的思路。