《眼科新进展》  2024年5期 354-359   出版日期：2024-04-30   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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连翘苷通过调控CTRP3表达对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞损伤的影响及其机制研究


糖尿病视网膜病变（DR）属于糖尿病微血管并发症之一，随着病情发展可导致失明或严重视力丧失^［1-2］。目前临床主要采用手术、药物治疗DR，但治疗效果不佳，既往研究显示，中医药已广泛用于治疗DR，由于个体因素导致目前治疗方案无法满足患者需求，因而需要积极寻找新型治疗方案^［3-4］。连翘苷（PHN）属于木犀科连翘属，具有抗菌、抗凋亡等作用，可促进衔接因子蛋白表达，抑制炎性反应，改善血管内皮细胞损伤^［5］。但PHN在DR治疗中的应用价值尚未完全阐明。补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白3（CTRP3）属于脂肪因子，与机体糖脂代谢异常有关，可参与DR发生发展过程^［6］。目前国内外关于PHN在高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞损伤方面的研究报道相对较少，本研究通过体外实验采用高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞构建DR细胞模型，探讨PHN对细胞损伤的影响，并分析其对CTRP3表达的调控作用，为进一步揭示PHN在DR治疗中的潜在作用机制奠定实验基础。
1　材料与方法　
1.1　主要试剂与仪器
人视网膜血管内皮细胞（合肥万物生物公司），PHN（纯度≥98%，西安汇林生物公司），细胞凋亡检测试剂盒、蛋白提取试剂盒（武汉艾美捷科技公司），Trizol试剂（美国Invitrogen公司），反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒（武汉科昊佳公司），兔抗人B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关蛋白（Bax）、CTRP3抗体（武汉亚科因生物公司），山羊抗兔辣根过氧化物酶（IgG）二抗（上海子起生物公司），丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），空载体（pcDNA）、CTRP3过表达载体（pcDNA-CTRP3）、慢病毒短发夹RNA的阴性对照（sh-NC）、CTRP3的慢病毒短发夹RNA（sh-CTRP3）（上海吉玛公司），Lipofectamine^TM 3000 Transfection Reagent试剂（北京索莱宝公司）。Spectramax iD多功能酶标仪（浙江美谷生物公司），实时荧光定量PCR（qRT-PCR）仪、Attune NxT流式细胞仪（美国Thermo Fisher公司）。
1.2　方法
人视网膜血管内皮细胞常规培养于DMEM培养基，选取含有5.5 mmol·L^-1葡萄糖的DMEM培养基培养的细胞为Con组。用含有30.0 mmol·L^-1葡萄糖的DMEM培养基培养的细胞为HG组^［7］。参照文献［8］，先分别用1 μmol·L^-1、10 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1 PHN处理48 h后收集细胞，然后用含有30.0 mmol·L^-1葡萄糖的DMEM培养基处理48 h，分别记为HG+PHN-L组、HG+PHN-M组、HG+PHN-H组。参照Lipofectamine^TM 3000 Transfection Reagent试剂说明书进行转染，分别将pcDNA、pcDNA-CTRP3转染至人视网膜血管内皮细胞48 h，收集细胞后用含有30.0 mmol·L^-1葡萄糖的DMEM培养基培养48 h，分别记为HG+pcDNA组、HG+pcDNA-CTRP3组。采用Lipofectamine^TM 3000 Transfection Reagent试剂，分别将sh-NC、sh-CTRP3转染至人视网膜血管内皮细胞48 h，收集细胞后用含有100 μmol·L^-1 PHN、30.0 mmol·L^-1葡萄糖的DMEM培养基培养48 h，分别记为HG+PHN-H+sh-NC组、HG+PHN-H+sh-CTRP3组。
1.3　观察指标
1.3.1　检测各组细胞MDA 、SOD 、GSH-Px 水平
收集1.2中各组培养48 h的细胞培养上清液，按照相应试剂盒说明书分别检测MDA（硫代巴比妥酸法）、SOD（黄嘌呤氧化酶法）、GSH-Px（比色法）水平。
1.3.2　检测各组细胞凋亡率
收集各组培养48 h的人视网膜血管内皮细胞，常规离心后弃上清，加入500 μL Binding Buffer悬浮细胞，按照凋亡检测试剂盒及Attune NxT流式细胞仪操作说明检测细胞凋亡率。
1.3.3　检测各组细胞CTRP3 mRNA相对表达量
采用Trizol法提取各组细胞总RNA，参照反转录试剂盒说明书合成cDNA，qRT-PCR扩增反应体系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正向和反向引物各0.8 μL，cDNA 2.0 μL，无菌无酶水（ddH₂O）补足体系至20 μL，采用2^-ΔΔCt法计算CTRP3 mRNA相对表达量。
1.3.4　检测各组细胞蛋白表达水平
各组细胞提取细胞总蛋白，蛋白高温变性，取30 μg变性蛋白进行SDS-PAGE，分离蛋白后转移至PVDF膜，分别加入Bax（1∶800）、Bcl-2（1∶800）、CTRP3（1∶800）一抗和内参GAPDH抗体（1∶2 000），4 ℃孵育过夜，加入IgG二抗稀释液（1∶3 000），37 ℃孵育1 h，曝光显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。
1.3.5　检测各组细胞活性
分别采用1 μmol·L^-1、10 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1PHN处理人视网膜血管内皮细胞48 h后收集细胞，分别设为PHN-L组、PHN-M组、PHN-H组，分别取Con组、PHN-L组、PHN-M组、PHN-H组细胞接种于96孔板（每孔1×10⁴个细胞），培养48 h后每孔加入20 μL MTT，37 ℃下孵育4 h，加入150 μL 二甲基亚砜，采用Spectras Max Plus微孔板读取器检测每孔吸光度（OD）值，并计算细胞活性=OD_实验组/OD_Con组×100%，实验组分别为PHN-L组、PHN-M组、PHN-H组。
1.4　统计学处理
采用SPSS 26.0统计学软件分析数据，计量资料以x?±s表示，且均符合正态分布，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准：α=0.05。
2　结果　
2.1　PHN对各组细胞活性的影响
Con组、PHN-L组、PHN-M组、PHN-H组细胞活性分别为（100.00±0.00）%、（98.76±10.93）%、（96.55±11.64）%、（95.37±12.43）%，4组间整体比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.2　PHN对各组细胞氧化应激的影响
Con组、HG组、HG+PHN-L组、HG+PHN-M组、HG+PHN-H组间细胞MDA、SOD、GSH-Px水平整体比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与Con组比较，HG组细胞MDA水平升高，SOD、GSH-Px水平均降低（均为P<0.05）；与HG组比较，HG+PHN-L组、HG+PHN-M组、HG+PHN-H组细胞MDA水平均降低，SOD、GSH-Px水平均升高（均为P<0.05），且MDA水平：HG+PHN-H组<HG+PHN-M组<HG+PHN-L组，SOD、GSH-Px水平：HG+PHN-H组>HG+PHN-M组>HG+PHN-L组（均为P<0.05）（表1）。



2.3　PHN对各组细胞凋亡的影响
Con组、HG组、HG+PHN-L组、HG+PHN-M组、HG+PHN-H组间细胞凋亡率、Bax蛋白水平、Bcl-2蛋白水平整体比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与Con组比较，HG组细胞凋亡率、Bax蛋白水平均升高，Bcl-2蛋白水平降低（均为P<0.05）；与HG组比较，HG+PHN-L组、HG+PHN-M组、HG+PHN-H组细胞凋亡率、Bax蛋白水平均降低，Bcl-2蛋白水平升高（均为P<0.05），且细胞凋亡率、Bax蛋白水平:HG+PHN-H组<HG+PHN-M组<HG+PHN-L组，Bcl-2蛋白水平：HG+PHN-H组>HG+PHN-M组>HG+PHN-L组（均为P<0.05）(图1、图2、表2)。










2.4　PHN对各组细胞CTRP3表达的影响
Con组、HG组、HG+PHN-L组、HG+PHN-M组、HG+PHN-H组间细胞CTRP3 mRNA及蛋白水平整体比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与Con组比较，HG组细胞CTRP3 mRNA及蛋白水平均降低（均为P<0.05）；与HG组比较，HG+PHN-L组、HG+PHN-M组、HG+PHN-H组细胞CTRP3 mRNA及蛋白水平均升高（均为P<0.05），且CTRP3 mRNA及蛋白水平:HG+PHN-H组>HG+PHN-M组>HG+PHN-L组（均为P<0.05）（图3、表3）。







2.5　CTRP3过表达对细胞损伤的影响
与HG+pcDNA组比较，HG+pcDNA-CTRP3组细胞凋亡率、MDA水平、Bax蛋白水平均降低，SOD水平、GSH-Px水平、CTRP3蛋白、Bcl-2蛋白水平均升高（均为P<0.05）（表4、图4、图5）。









2.6　干扰CTRP3表达联合PHN对细胞损伤的影响
与HG+PHN-H+sh-NC组比较，HG+PHN-H+sh-CTRP3组细胞凋亡率、MDA水平、Bax蛋白水平均升高，SOD水平、GSH-Px水平、CTRP3蛋白、Bcl-2蛋白水平均降低（均为P<0.05）（图6、图7、表5）。










3　讨论
DR发病机制可能与基因异常表达、人视网膜血管内皮细胞过度凋亡、氧化应激反应、炎性水平、糖脂代谢紊乱、微循环障碍等有关^［9-11］。若DR未得到及时治疗可导致视力降低甚至失明，因而寻找安全可靠的治疗药物具有重要意义。
PHN可抑制神经元细胞氧化应激、凋亡等^［12］。PHN可减轻脑组织病理改变，抑制中性粒细胞浸润、活性氧生成、促炎细胞因子分泌，减轻创伤性脑损伤^［13］。PHN可抑制Toll样受体4（TLR4）信号通路活化，降低炎性因子表达水平，并可促进巨噬细胞胆固醇流出，发挥抗氧化应激作用，进而缓解脂多糖诱导的急性肾损伤^［14］。PHN可抑制氧化应激反应、神经细胞凋亡，减轻脑缺血-再灌注损伤^［15］。由此推测，PHN可能通过抑制氧化应激、炎性反应减轻细胞损伤程度。本研究结果显示，HG诱导的人视网膜血管内皮细胞中MDA水平升高，SOD、GSH-Px水平降低，与既往研究结果相似^［16］。本研究发现，不同剂量PHN处理后MDA水平降低，SOD、GSH-Px水平升高，提示PHN可激活抗氧化系统。本研究结果显示，HG处理后细胞凋亡率、Bax蛋白水平升高，而Bcl-2蛋白水平降低，这与既往研究报道相似^［17］。DR发生过程中炎性因子可引发级联反应，促使细胞非程序性凋亡。本研究发现，采用PHN处理后可减弱细胞凋亡能力，提示PHN可改善人视网膜血管内皮细胞凋亡状态，促凋亡基因水平下降，抑凋亡基因水平升高。结合既往研究推测，PHN可能通过调控PI3K/AKT信号通路、PPARγ通路、TLR4通路等发挥抗炎、抗凋亡作用，进而保护人视网膜血管内皮细胞。
CTRP3属于抗炎因子，可抑制单核/巨噬细胞相关促炎通路，促进脂联素等抗炎因子表达，并可抑制核因子-κB（NF-κB）信号通路活化，介导多条途径发挥抗炎作用，以此减轻心肌组织缺血-再灌注损伤^［18］。CTRP3在海马神经元细胞损伤中表达下调，上调其表达可增强海马神经元细胞活力，减轻氧化应激反应，增强SOD、GSH-Px活性，并可上调Bcl-2水平，其可能调节AMPK/Nrf2/ARE途径^［19］。氧-葡萄糖剥夺/再灌注（OGD/R）诱导的脑微血管内皮细胞损伤中CTRP3呈低表达，可抑制细胞凋亡，降低氧化应激水平，其可能通过调节核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1（Nrf2/HO-1）信号通路改善OGD/R诱导的脑微血管内皮细胞损伤、屏障功能障碍^［20］。本研究结果显示，HG处理后细胞中CTRP3 mRNA和蛋白呈低表达，而使用PHN处理后CTRP3 mRNA和蛋白水平明显升高，提示PHN可能通过上调CTRP3表达进而发挥抗炎、抗凋亡作用。为进一步验证上述推测，本研究针对CTRP3分别进行过表达、干扰表达处理，结果发现，CTRP3过表达可降低HG诱导的人视网膜血管内皮细胞氧化应激水平，抑制细胞凋亡，而干扰其表达可减弱PHN对HG诱导的人视网膜血管内皮细胞损伤的作用，提示PHN可能通过调节CTRP3表达而减轻HG诱导的人视网膜血管内皮细胞损伤。
4　结论
PHN处理HG诱导的人视网膜血管内皮细胞后，可降低氧化应激水平、凋亡水平，并可上调CTRP3表达，其对细胞损伤的保护作用机制可能与调控CTRP3表达有关，但关于其通过哪种途径调节CTRP3表达尚需进一步探究，同时在细胞实验方面需要深入探讨相关信号通路的变化，并进行相关实验进一步验证信号通路的潜在作用机制。