《眼科新进展》  2024年5期 346-349   出版日期：2024-04-30   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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衣康酸二甲酯对树突状细胞分泌促炎因子以及实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠辅助性T细胞17的影响


自身免疫性葡萄膜炎（AU）是一种易复发的常见致盲性眼病，其病因和发病机制尚未完全明确^［1］。目前临床常应用糖皮质激素或联合应用免疫抑制剂进行治疗，但其长期应用对眼部及全身其他器官具有一定毒副作用。虽然新型生物制剂具有更强的靶向性，但在全身应用时，会增加感染或患恶性肿瘤的风险^［2］。因此，寻找安全有效的治疗方法是眼科临床亟待解决的问题。衣康酸二甲酯（DMI）是一种具有细胞渗透性的衣康酸衍生物，其可以通过调节固有免疫反应发挥抗炎作用^［3-4］。研究发现，DMI处理能够显著抑制脂多糖（LPS）刺激的骨髓来源巨噬细胞中白细胞介素（IL）-6的表达，进而减轻心肌缺血-再灌注引发的炎症反应^［5］。此外，Kuo等^［4］研究发现，腹腔注射DMI可通过抑制小胶质细胞的激活改善实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的神经炎症^［4］。树突状细胞（DCs）作为一种专职抗原提呈细胞，在固有免疫和适应性免疫间发挥桥梁和纽带作用^［6］，其可以通过呈递抗原、提供共刺激信号以及改变细胞因子环境调控辅助性T细胞17（Th17）的细胞反应^［7］。然而，DMI对DCs功能的影响及其进一步对适应性免疫中Th17细胞的调控尚未见报道。因此，本研究探讨DMI对小鼠骨髓来源DCs的作用，并初步研究其对实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）小鼠光感受器间维生素A类结合蛋白1-20（IRBP_1-20）特异性Th17细胞的影响，现将结果报告如下。
1　材料与方法　
1.1　主要试剂及仪器
DMI、佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）、钙离子霉素、布雷菲尔德菌素A（BFA）（美国 Sigma公司）；RPMI 1640基础培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国HyClone公司）；重组小鼠蛋白粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IL-4、IL-23、小鼠IL-17蛋白酶联免疫吸附实验（ELISA）检测试剂盒（美国R&D公司）；弗氏不完全佐剂（IFA）、合成多肽段IRBP_1-20（上海生物工程股份有限公司）；结核分枝杆菌H37RA（美国Difco公司）；固定破膜液、异硫氰酸荧光素（FITC）偶联的抗小鼠 IL-17抗体（FITC-IL-17）、逆转录试剂盒、2×实时荧光定量PCR（qRT-PCR)扩增预混液（美国Thermo 公司）。
1.2　实验动物
6~8周龄无特定病原体级健康雌性C57BL/6J小鼠12只（北京维通利华实验动物技术有限公司），体重（20±1）g。实验动物的饲养及操作符合国家科学技术委员会《实验动物管理条例》的规定，并获得天津医科大学动物管理及使用委员会的批准（批文号：TJYY2019110117）。
1.3　骨髓来源DCs的诱导与处理
取6只C57BL/6J小鼠颈椎脱臼法处死后，于超净操作台中分离双侧股骨和胫骨，用RPMI 1640将骨髓腔反复冲洗得到骨髓细胞，使用无菌棉花柱滤掉残余组织碎片，用冷冻离心机将滤液在4℃条件下，300×g离心8 min，吸弃上清液。将离心管底部细胞用RPMI 1640完全培养基重悬，计数，以每孔200万细胞接种于12孔细胞培养板，并且加入终浓度均为10 μg·L^-1的GM-CSF和IL-4诱导细胞向DCs分化。
收集诱导分化6 d的DCs，将其分为DMI组和PBS组，分别使用250 μmol·L^-1 DMI或等量PBS预处理3 h，随后向每组加入100 μg·L^-1LPS刺激24 h诱导DCs分化成熟，之后收集细胞进行共培养或使用qRT-PCR检测两组DCs中促炎因子IL-6、IL-1β和IL-23 mRNA的相对表达量。
1.4　EAU模型的建立以及脾脏和淋巴结T细胞制备
取6只C57BL/6J小鼠，按每只小鼠150 μg IRBP_1-20、0.8 mg结核分枝杆菌H37RA和90 μl IFA的剂量配制抗原乳化剂，在给予小鼠350 ng百日咳毒素2 h后，将配制好的乳化剂注射于小鼠单后足垫及脊柱两侧皮下，建立EAU模型^［8］。在免疫后13 d，于超净台内取小鼠脾脏以及淋巴结，随后使用尼龙柱分离纯化T细胞。将1.3中制备的DCs经IRBP_1-20预处理后，与制备好的T细胞进行共培养，并加入IL-23诱导其向Th17细胞方向极化，48 h后收集细胞备用。
1.5　qRT-PCR检测基因相对表达量
使用RNA提取试剂盒裂解细胞并按说明书中操作步骤提取样本总RNA，之后将提取的RNA进行逆转录制备cDNA，以cDNA为反应模板，以β-actin为内参照，行qRT-PCR检测共培养细胞中IL-17、维甲酸相关核孤儿受体γt（RORγt）、GM-CSF和IL-23 mRNA的相对表达量。反应引物序列见表1，反应体系：cDNA模板2 μL，SYBR Green 2× Master Mix 4 μL，正向、反向引物各1 μL。按2^-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。
1.6　ELISA检测共培养上清液中IL-17的水平
按1.4中方法共培养细胞48 h后，收集各组细胞培养上清液，根据小鼠IL-17蛋白ELISA试剂盒说明书检测其在共培养细胞上清液中的水平。



1.7　流式细胞仪检测共培养细胞中Th17细胞比例
按1.4中方法共培养7 d后收集细胞，使用刺激液（每孔0.6 mL RPMI 1640完全培养基）并加入PMA（50 μg·L^-1）、BFA（1 mg·L^-1）和钙离子霉素（1 mg·L^-1）重悬细胞后置于细胞培养箱中刺激 4~6 h；刺激完成后使用抗体封闭细胞表面Fc受体，随后进行相应染色；最后使用流式细胞仪检测Th17（CD4+IL-17+T）细胞比例，染色过程需在避光条件下进行。
1.8　统计学方法
采用SPSS 26.0统计学软件进行统计分析，数据均以均数±标准差表示，组间差异比较使用独立样本t检验。检验水准：α=0.05。
2　结果　
2.1　PBS组与DMI组DCs中IL-6、IL-1β和IL-23 mRNA相对表达量的比较
qRT-PCR检测结果显示，DMI组DCs中IL-6、IL-1β和IL-23 mRNA相对表达量分别为0.445 5±0.130 9、0.575 0±0.076 8、0.487 1±0.057 5，与PBS组（1.001 6±0.068 7、1.001 6±0.068 5、1.012 9±0.190 7）相比均明显降低，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。
2.2　PBS组与DMI组共培养细胞中Th17细胞比例分析
流式细胞仪检测结果显示，DMI组共培养细胞中Th17细胞比例为（17.70±4.25）%，明显低于PBS组（21.6±4.03）%，差异有统计学意义（P<0.05）（图1）。
2.3　各组共培养上清液中IL-17分泌水平的比较
ELISA检测结果显示，DMI组共培养上清液中IL-17水平为（2 989.28 ± 197.89）ng·L^-1，明显低于PBS组（3 905.63 ± 340.84）ng·L^-1，差异有统计学意义（P<0.05）。



2.4　两组共培养细胞中IL-17、RORγt、GM-CSF和IL-23R mRNA相对表达量的比较
qRT-PCR检测结果显示，DMI组共培养细胞中IL-17、RORγt、GM-CSF和IL-23R mRNA相对表达量分别为0.437 1±0.137 1、0.535 8±0.129 3、0.442 9±0.121 3、0.713 3±0.150 3，均明显低于PBS组（1.035 2±0.251 8、0.901 4±0.142 3、1.019 3±0.205 9、1.045 0±0.148 7），差异均有统计学意义（均为P<0.05）。
3　讨论
Th17细胞是CD4+T细胞中重要的细胞亚群，能够特异性表达RORγt，并通过分泌IL-17等炎性细胞因子促进自身免疫性眼病的发生发展^［9-10］。在AU患者血液样本中发现，活性期患者Th17细胞比例以及IL-17水平显著升高，且其表达水平与疾病严重程度呈正相关^［11］。因此，抑制Th17细胞反应将可能有助于缓解AU的发生发展。DCs是一种重要的固有免疫细胞，可以发挥抗原提呈作用并通过产生IL-6、IL-1β以及IL-23等促炎因子调控Th17细胞的免疫应答^［12-13］。近年来，DMI调节巨噬细胞功能和外周炎症免疫反应的作用已经得到证实^［14-15］。Zhang等^［16］研究发现，DMI可以通过减少巨噬细胞中IL-6的产生，从而减轻脓毒血症的炎症反应。Kuo等^［4］对实验性自身免疫性脑脊髓炎的研究表明，DMI减轻了血-脑屏障的破坏，抑制了小胶质细胞的活化以及外周的Th17细胞反应。然而，DMI对DCs以及EAU中IRBP_1-20特异性Th17细胞的调控尚未见报道。本研究观察了DMI对DCs表达促炎因子以及进一步对EAU中IRBP_1-20特异性Th17细胞反应的影响。
DCs分泌的促炎因子（如IL-6、IL-1β以及IL-23等）在调控Th17细胞反应中发挥至关重要的作用。本研究结果显示，DMI处理DCs显著抑制了促炎因子（IL-6、IL-1β以及IL-23）的产生。Lin等^［17］研究表明，在真菌性角膜炎中DMI可以抑制巨噬细胞中IL-6和IL-1β的表达。此外，Nakkala等^［18］发现,DMI可以抑制巨噬细胞中IL-6和IL-23的表达进而部分减轻心肌梗死引发的炎症反应。IL-6可以增强Th17细胞反应，这与其抑制T细胞中Foxp3的表达，从而解除RORγt抑制有关；IL-1β在Th17细胞的发育阶段发挥关键作用，而IL-23对于维持Th17细胞的致病性至关重要^［19］。这与本研究结果共同表明，DMI处理DCs可能创造了抑制Th17细胞活化的免疫微环境。为了进一步探讨DMI干预的DCs对EAU中Th17细胞活性的影响，我们将经DMI处理的DCs与IRBP_1-20特异性T细胞在Th17细胞极化条件下共培养。结果表明，DMI组较PBS组显著降低了Th17细胞中IL-17和RORγt表达。同时，ELISA检测结果也显示，DMI组细胞共培养上清液中IL-17水平明显低于PBS组。此外，流式细胞仪检测结果显示，DMI组Th17细胞比例明显低于PBS组，表明DMI处理的DCs抑制了Th17细胞的极化。以上结果共同表明，DMI可以抑制DCs分泌促炎因子IL-6、IL-1β以及IL-23，进而降低IRBP_1-20特异性Th17细胞反应。
IL-23R和GM-CSF对于Th17细胞致病效应功能至关重要。为了探讨DMI处理的DCs对 EAU中致病性Th17细胞相关因子表达的影响，我们进一步检测了共培养细胞中GM-CSF、IL-23R mRNA的表达水平。结果显示，DMI组DCs较PBS组能够显著抑制IRBP_1-20特异性Th17细胞中GM-CSF和IL-23R mRNA的表达。研究表明，Th17细胞表面的IL-23R接受IL-23刺激后，诱导RORγt、IL-17和IL-23R的转录，进而维持致病性Th17细胞表型，促进自身免疫性疾病的发生发展^［20］。GM-CSF是自身免疫性疾病中高致病性细胞因子，可促进DCs、单核细胞和巨噬细胞等向促炎方向活化。活化的巨噬细胞及DCs进一步分泌IL-6和IL-23等赋予Th17细胞致病性的细胞因子，正反馈促进GM-CSF和IL-23R的表达，从而维持致病性Th17细胞反应^［21-22］。综上，本研究结果表明，DMI可能通过作用于DCs，进而降低致病性Th17细胞反应。
4　结论
DMI能够降低DCs中促炎因子IL-6、IL-1β和IL-23的表达，进而抑制IRBP_1-20特异性Th17细胞反应。本研究仅体外探讨了DMI对DCs表达促炎因子以及EAU中IRBP_1-20特异性Th17细胞活性的影响，而DMI在EAU小鼠体内是否能够发挥免疫治疗作用仍有待进一步探究。