《眼科新进展》  2024年4期 275-281   出版日期：2024-04-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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HTRA3基因对脉络膜新生血管和M2型巨噬细胞极化的影响


湿性年龄相关性黄斑变性（wAMD）是一种累及视网膜黄斑区的眼病之一，在老年人群中具有较高的发病率^［1-2］。脉络膜新生血管（CNV）是wAMD的典型病变，也是导致患者视力丧失的主要原因^［3］。目前，虽然玻璃体内注射血管内皮生长因子（VEGF）抑制剂在治疗wAMD方面取得了一定疗效^［4］，然而，抗VEGF药物存在耐药性问题^［5］，并且会引起眼压升高^［6］、眼部感染^［7］等并发症，因此，仍需要开发AMD的新型治疗手段。免疫微环境失衡是导致wAMD的始发因素，wAMD病变部位出现大量巨噬细胞浸润，这些巨噬细胞通过分泌VEGF和炎性因子促进血管内皮细胞增殖并引起新生血管渗漏，导致wAMD形成^［8］。巨噬细胞具有可塑性，可极化为M1和M2型，其中M2型极化可导致脉络膜血管形成^［9-10］。因此，调控巨噬细胞表型是治疗wAMD的有效途径。HtrA丝氨酸肽酶3（HTRA3）是2003年首次报道的一个蛋白质编码基因，位于染色体4p16.1上^［11］。HTRA3与HTRA1类似，都能抑制转化生长因子-β家族蛋白介导的信号通路^［12］。据报道，HTRA1基因启动子里的一个单核苷酸多态性与AMD有关联，含有HTRA1多态性的人群发生AMD的危险度比正常人高10倍^［13-14］。HTRA3在AMD小鼠视网膜中表达升高，提示HTRA3很可能参与AMD病变的进展^［15］。另外，HTRA3可能调节免疫细胞功能^［16］。本研究旨在揭示HTRA3基因对CNV和M2型巨噬细胞极化的影响，从而开发AMD的新型治疗靶标。
1　材料与方法　
1.1　材料
1.1.1　实验试剂
慢病毒载体由吉玛基因合成。RPMI 1640培养基（货号：22400105）购自美国Gibco公司。氯化钴（CoCl₂）（货号：C8661）购自美国Sigma公司。Lipofectamine2000（货号：11668027）购自美国Invitrogen公司。Matrigel（货号：356234）购自美国BD Biosciences公司。苏木精伊红（HE）染色试剂盒（货号：C0105S）、TRIzol（货号：R0016）、RIPA裂解液（货号：P0013B）、ECL试剂盒（货号：P0018S）购自碧云天生物技术研究所。荧光素钠（货号：A833）购自美国Thermo Fisher公司。Prime Script RT Master Mix试剂盒（货号：RR036A）购自日本TaKaRa公司。SYBR Green Master Mix（货号：4367659）购自美国ABI公司。HTRA3（货号：ab227463）、VEGFA（货号：ab46154）、核因子κB（NF-κB）p65（货号：ab288751）、Lamin B（货号：ab32535）和β-actin（货号：ab8226）一抗以及HRP标记的IgG二抗（货号：ab205718）购自英国Abcam公司。
1.1.2　实验细胞和动物
恒河猴脉络膜血管内皮细胞系（RF/6A）购自美国ATCC。60只SPF级雄性老龄C57BL/6J小鼠（18～20个月龄，体重35～40 g）由西北大学提供［SYXK（陕）2021-004］。小鼠在25 ℃、55%相对湿度、12 h循环照明环境中使用标准小鼠饲料和纯净水饲养。
1.2　方法
1.2.1　血清样本收集
2019年1月至2022年8月期间，收集西安市人民医院（西安市第四医院）就诊的30例wAMD患者为wAMD组，其中男16例，女14例，年龄51~78（68.81±6.09）岁，参考wAMD国际诊断标准^［17］对患者进行诊断。剔除伴有其他视网膜疾病、恶性肿瘤、心脑血管系统疾病、器官病变及接受治疗的wAMD患者。收集同期来院体检的健康者30例为健康组，其中男15例，女15例，年龄53~81（70.43±6.42）岁。健康组与wAMD组受试者的年龄、性别比例相比,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。收集两组受试者的空腹静脉血，qRT-PCR检测血清HTRA3 mRNA水平。本研究通过西安市人民医院（西安市第四医院）伦理委员会审批（审批号：201901170025），受试者均知情同意。
1.2.2　细胞培养与转染处理
将RF/6A细胞培养在添加体积分数10%胎牛血清和10 g·L^-1双抗的RPMI 1640培养基中，置于37 ℃和含体积分数5%CO₂的细胞培养箱中培养。细胞生长至对数期后用于实验。将RF/6A细胞随机分为对照组、NC-sh组和HTRA3-sh组，6孔板中接种RF/6A细胞并培养至80%融合，按照试剂盒说明，使用Lipofectamine2000将NC-shRNA和HTRA3-shRNA慢病毒载体分别转染到NC-sh组和HTRA3-sh组RF/6A细胞。对照组细胞不进行转染。转染48 h后，通过qRT-PCR和Western blot检测HTRA3的转染效率。每组设置6个复孔。
1.2.3　细胞分组及处理
验证HTRA3转染效率后，将RF/6A细胞随机分为N组、H组、H+NC-sh组和H+HTRA3-sh组。其中，H+NC-sh组和H+HTRA3-sh组细胞分别转染NC-shRNA和HTRA3-shRNA；N组RF/6A细胞在完全RPMI 1640培养基中进行常氧培养，其他组细胞在添加200 mmol·L^-1 CoCl₂的RPMI 1640培养基中进行低氧培养。每组设置6个复孔。
1.2.4　小管形成测定
使用Matrigel（每孔80 μL）包被96孔板，室温静置30 min，加入1.2.3分组处理后的细胞30 μL（每孔5×10⁴个RF/6A细胞），培养6 h后在显微镜下观察小管形成情况，Image-Pro Plus 6.0软件计算闭合管腔数量。每组设置6个复孔。
1.2.5　激光诱导CNV小鼠模型
使用复方托吡酰胺滴眼液对小鼠进行散瞳，10 g·L^-1苯巴比妥钠经腹腔注射麻醉小鼠（10 mL·kg^-1）。围绕视盘用氩激光（激光波长350 nm，输出功率350 mW，曝光时间0.1 s，光斑直径75 μm）对小鼠双眼发射四个激光点。光凝后有白色气泡产生证实Bruch膜破裂，表明建模成功。
1.2.6　动物分组及处理
将小鼠随机分为对照组、CNV组、CNV+NC-sh组和CNV+HTRA3-sh组，每组12只。对照组为未建模的小鼠，其他组为CNV建模成功的小鼠。使用盐酸奥布卡因进行表面麻醉，然后使用30G穿刺针头向CNV+NC-sh组和CNV+HTRA3-sh组小鼠玻璃体内分别注射1 μL滴度为1×10¹¹ TU·mL^-1的NC-shRNA和HTRA3-shRNA慢病毒载体，对照组和CNV组小鼠玻璃体内注射PBS，均为双眼注射。注射后给予左氧氟沙星滴眼液抗感染。
1.2.7　荧光素眼底血管造影
注射后7 d，所有小鼠均行荧光素眼底血管造影（FFA）检查。使用复方托吡酰胺滴眼液对各组小鼠进行散瞳，10 g·L^-1苯巴比妥钠经腹腔注射麻醉小鼠（10 mL·kg^-1）。然后经腹腔注射0.05 mL 100 g·L^-1荧光素钠，2~3 min后拍摄眼底照片，在480 nm激发光和525 nm发射光下使用滤光片获取图像。使用ImageJ软件计算CNV的平均荧光强度。
1.2.8　样本收集
所有小鼠FFA检查结束后处死，摘取双眼眼球，取双眼中任意一只眼球行40 g·L^-1多聚甲醛固定，用于HE染色；另一只眼球在显微镜下冰上小心去除结缔组织和肌肉，去除眼前节，分离出脉络膜组织，与生理盐水混合并研磨匀浆，用于qRT-PCR和Western blot检测。
1.2.9　眼球HE染色
40 g·L^-1多聚甲醛固定眼球24 h。常规制成4 μm厚的石蜡切片，根据试剂盒说明进行HE染色。
1.2.10　qRT-PCR检测
通过qRT-PCR检测wAMD患者和健康体检者的血清中HTRA3 mRNA水平，并检测RF/6A细胞或各组小鼠脉络膜组织中HTRA3、类几丁质酶3样蛋白3（Ym-1）、精氨酸酶1（Arg-1）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧化酶-2（COX-2）和VEGFA mRNA水平。TRIzol试剂提取总RNA。使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，然后在ABI Prism 7900HT型荧光定量PCR仪上使用SYBR Green Master Mix进行扩增。扩增程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，循环40次。引物序列见表1。GAPDH为内参基因。通过2^-ΔΔCt法计算基因相对表达量。


1.2.11　Western blot检测
通过RIPA裂解液提取RF/6A细胞或小鼠脉络膜组织总蛋白，然后在100 g·L^-1 SDS-PAGE上分离蛋白并转移到PVDF膜上，50 g·L^-1脱脂牛奶室温封闭30 min。然后与1∶5 000稀释的HTRA3、VEGFA、NF-κB p65、Lamin B和β-actin一抗在4 ℃下孵育过夜。然后将膜与1∶5 000稀释的HRP标记的IgG二抗在室温下孵育2 h。ECL显影，ImageJ软件测定条带灰度值。Lamin B作为核蛋白内参，β-actin 作为总蛋白内参。
1.3　统计学分析
使用SPSS 21.0软件行统计分析，定量数据采用均数±标准差表示。组间差异比较采用t检验或单向方差分析。检验水准：α=0.05。
2　结果　
2.1　wAMD患者和健康体检者的血清HTRA3 mRNA水平
与健康组（1.00±0.33）比较，wAMD组患者的血清中HTRA3 mRNA水平（2.41±0.57）升高，差异有统计学意义（t=11.804，P<0.001）。
2.2　下调HTRA3抑制缺氧诱导的RF/6A细胞小管形成
RF/6A细胞转染后，与对照组和NC-sh组比较，HTRA3-sh组RF/6A细胞的HTRA3 mRNA和蛋白表达水平均降低（均为P<0.05）（表2和图1）。缺氧处理后，与N组比较，H组RF/6A细胞的闭合管腔数量、HTRA3和VEGFA的mRNA和蛋白表达水平均增加（均为P<0.05）；与H+NC-sh组比较，H+HTRA3-sh组RF/6A细胞的闭合管腔数量、HTRA3和VEGFA的mRNA和蛋白表达水平均减少（均为P<0.05）；H组与H+NC-sh组RF/6A细胞的闭合管腔数量、HTRA3和VEGFA的mRNA和蛋白表达水平相比，差异均无统计学意义（均为P>0.05)（表3、图2、表4和图3）。




















2.3　下调HTRA3抑制CNV小鼠脉络膜血管生成
与对照组比较，CNV组小鼠的HTRA3 mRNA和蛋白表达水平均增加（均为P<0.05）；与CNV+NC-sh组比较，CNV+HTRA3-sh组小鼠的HTRA3 mRNA和蛋白表达水平均减少（均为P<0.05）；CNV组与CNV+NC-sh组小鼠的HTRA3 mRNA和蛋白表达水平相比，差异均无统计学意义（均为P>0.05)（表5和图4）。对照组小鼠脉络膜形态正常；CNV组和CNV+NC-sh组小鼠脉络膜结构紊乱，脉络膜增生，Bruch膜破裂，血管生成增加；CNV+HTRA3-sh组小鼠脉络膜病变减轻，脉络膜增生和血管生成减少（图5）。与对照组比较，CNV组小鼠的CNV相对荧光强度升高（P<0.05）；与CNV+NC-sh组比较，CNV+HTRA3-sh组小鼠的CNV相对荧光强度降低（P<0.05）;CNV组与CNV+NC-sh组小鼠的CNV相对荧光强度相比，差异无统计学意义（P>0.05)（表5和图5）。
2.4　下调HTRA3对CNV小鼠脉络膜组织中巨噬细胞极化的影响
与对照组比较，CNV组小鼠脉络膜组织中M2型巨噬细胞标志物Ym-1和Arg-1 mRNA水平升高，M1型巨噬细胞标志物iNOS和COX-2 mRNA水平降低（均为P<0.05）；与CNV+NC-sh组比较，CNV+HTRA3-sh组小鼠脉络膜组织中Ym-1和Arg-1 mRNA水平降低，iNOS和COX-2 mRNA水平升高（均为P<0.05）；CNV组与CNV+NC-sh组小鼠脉络膜组织中Ym-1、Arg-1、iNOS和COX-2 mRNA水平相比，差异均无统计学意义（均为P>0.05)（表6）。













2.5　下调HTRA3对CNV小鼠脉络膜组织NF-κB信号通路的影响
对照组、CNV组、CNV+NC-sh组和CNV+HTRA3-sh组小鼠脉络膜组织中的细胞核NF-κB p65蛋白相对表达量依次为1.00±0.05、3.41±0.27、3.39±0.35、1.87±0.11（F=315.393，P<0.001）。与对照组比较，CNV组小鼠的脉络膜组织中细胞核NF-κB p65蛋白表达水平升高（P<0.05）；与CNV+NC-sh组比较，CNV+HTRA3-sh组小鼠的脉络膜组织中细胞核NF-κB p65蛋白表达水平降低（P<0.05）；CNV组与CNV+NC-sh组小鼠脉络膜组织中细胞核NF-κB p65蛋白表达水平相比，差异无统计学意义（P>0.05）（图6）。



3　讨论
CNV是wAMD患者视力丧失的主要原因，虽然抗VEGF治疗可以抑制CNV形成，但也可能引起多种并发症^［6-7］，因此，仍需要开发新型wAMD治疗手段和治疗靶点。HtrA家族是一种热休克诱导的蛋白酶家族，在进化过程中非常保守，该家族成员不仅参与调节细胞存活、线粒体稳态、胎盘发育等多种生理功能，而且参与癌症、神经退行性疾病、关节炎等多种病理过程的发生和发展^［18］。目前，HtrA家族成员中HTRA1的研究较多。据报道，HTRA1多态性与AMD的发生相关^［13-14］。CNV患者房水中的HTRA1水平高于白内障患者，并且经雷珠单抗玻璃体内注射治疗后HTRA1水平降低^［19］。HTRA-1调节血管生成功能，HTRA-1的升高与早产儿视网膜病变的发生风险相关^［20］。然而，HTRA3在wAMD中的研究较少。本研究观察到wAMD患者的血清HTRA3 mRNA水平较健康人明显升高，提示HTRA3可能参与了AMD的发病过程。由于HTRA3与HTRA1具有高度同源性和结构相似性，这两种酶在人体组织中的表达模式相似，提示它们可能具有相似的生物学活性和互补的生理功能^［12］。据报道，HTRA3在AMD小鼠视网膜中表达升高^［15］。
视网膜缺氧是wAMD的主要病因之一^［21］，缺氧可诱导CNV形成^［22-23］。本研究通过转染HTRA3-shRNA慢病毒下调了RF/6A细胞中的HTRA3，然后对RF/6A细胞进行缺氧处理，结果表明，下调HTRA3抑制了缺氧诱导的RF/6A细胞小管形成，并下调了VEGFA的表达。另外，激光诱导CNV是一种模拟了人类wAMD的动物建模方法^［24］。本研究建立了激光诱导的CNV小鼠模型，然后对小鼠玻璃体内注射HTRA3-shRNA慢病毒，结果表明，下调HTRA3减轻了CNV小鼠脉络膜病变，抑制了血管生成和CNV生成。Nie等^［25］报道，HTRA3是一种含有胰岛素样生长因子（IGF）结合结构域的新型丝氨酸蛋白酶，在小鼠胎盘形成过程中在母胎界面选择性表达，HTRA3在介导血管和胎盘形成中起着关键作用。本研究证实，HTRA3水平影响RF/6A细胞小管形成及血管生成因子VEGFA的表达水平。据报道，HTRA3是一种调节脑内皮细胞特异性应答的基因，与前脑血管发育有关^［26］。敲除HTRA3抑制了滋养层细胞的侵袭和血管生成^［27］。这些结果说明HTRA3可促进血管生成和CNV形成。
wAMD发病过程中免疫微环境失衡，大量巨噬细胞浸润是免疫微环境失衡的重要因素，因为巨噬细胞可促进血管内皮细胞增殖并引起新生血管渗漏^［8］。wAMD发病过程中巨噬细胞主要通过M2型极化诱导CNV形成^［9-10］。巨噬细胞发生M2型极化后可分泌包括VEGF在内的多种促血管生成因子。本研究结果表明，下调HTRA3降低了CNV小鼠脉络膜组织中M2型巨噬细胞标志物（Ym-1和Arg-1）的表达，上调了M1型巨噬细胞标志物（iNOS和COX-2）的表达，抑制了M2型巨噬细胞极化。有学者研究表明，HTRA家族的基因突变影响巨噬细胞的存活率^［28］。另外，HTRA3与胃癌的免疫细胞浸润程度相关^［16］。HTRA3的高表达与获得性免疫细胞（Th17细胞、T辅助细胞、T中央记忆细胞等）呈负相关，与天然免疫细胞（NK细胞、肿瘤相关巨噬细胞、未成熟树突状细胞等）呈正相关^［16］。因此我们推测，HTRA3可能通过促进M2型巨噬细胞极化参与了wAMD发病过程。
NF-κB信号通路参与激活wAMD患者脉络膜和视网膜中的炎症反应^［29］，NF-κB信号通路的激活与CNV形成有关^［30］，NF-κB信号通路的激活在包括wAMD在内的多种疾病中起到促进血管生成作用^［31-32］。因此，抑制NF-κB信号通路是治疗wAMD的有效策略^［33］。其他学者报道，HTRA3高表达可能激活NF-κB通路^［16］。本研究结果表明，下调HTRA3抑制CNV小鼠脉络膜组织NF-κB的核转位。据报道，NF-κB p65可直接与HTRA1启动子（氨基酸347）结合，阻断HTRA1可显著抑制NF-κB信号通路^［34］。考虑到HTRA3与HTRA1具有高度同源性和结构相似性，并且表达模式相似^［12］，我们推测，HTRA3可能与NF-κB p65具有结合位点，下调HTRA3对CNV形成的抑制作用也可能与抑制NF-κB信号通路有关。
4　结论
HTRA3可促进血管生成和CNV形成，可能通过促进M2型巨噬细胞极化参与了wAMD的发病过程，通过下调HTRA3可抑制CNV形成和M2型巨噬细胞极化，该作用可能与NF-κB信号通路有关。本研究结果提示，HTRA3可能是防治wAMD的重要潜在靶点。