《眼科新进展》  2024年4期 270-274   出版日期：2024-04-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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葡萄糖转运蛋白GLUT1/4和Sirtuins在糖尿病大鼠视网膜中的表达


糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病严重的微血管并发症，也是导致成人视力丧失的主要原因^［1］，探索DR的发病机制，寻找其预防及治疗方法具有重要的临床意义。葡萄糖转运蛋白GLUT是一类可调控葡萄糖进入细胞内的跨膜蛋白。目前已鉴定出GLUT家族包含14种蛋白，GLUT1是主要的葡萄糖转运载体，参与葡萄糖代谢^［2-3］；GLUT4能够在胰岛素的刺激下，通过易位作用转运到细胞膜上调控葡萄糖进入细胞^［4］。此外，Sirtuins作为一类具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性去乙酰酶活性的蛋白，已被证明与心血管疾病、糖尿病、癌症等有密切关系^［5］。本研究探讨GLUT1/4和Sirtuins在糖尿病大鼠视网膜中的表达，旨在进一步研究DR的发病机制。
1　材料与方法　
1.1　主要试剂和仪器
链脲佐菌素、无水乙醇、二甲苯、中性树胶、HE染色试剂盒 (北京索莱宝科技有限公司)，BCA蛋白定量检测试剂盒、全蛋白提取试剂盒、ECL化学发光液(江苏凯基生物技术股份有限公司)，DAB显色试剂盒 (上海生工生物工程股份有限公司),SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、预染蛋白Maker (上海雅酶生物医药科技有限公司),SIRT1、SIRT6抗体 (美国Cell Signaling公司),β-actin、SIRT2、SIRT3和SIRT7抗体 (美国Affinityg公司),SIRT4、STRT5和GLUT1/4抗体 (武汉三鹰生物技术有限公司)。全数字彩色多普勒超声诊断仪 (上海中跃医疗仪器公司),台式高速冷冻型微量离心机 (北京大龙兴创实验仪器公司),荧光定量PCR仪 (美国Bio-Rad公司),化学发光成像仪 (美国Thermo Scientific公司),黏附载玻片、YD-14P1.5智能环保型双吊篮生物组织脱水机、YD-6LA生物组织冷冻包埋机、RWDS700轮转式切片机、YD-700全自动生物组织染色机 (深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，ML31生物显微镜(广州市明美科技有限公司)，Science数字切片扫描系统 (山东志盈医学科技有限公司)。
1.2　糖尿病大鼠模型的建立
取8周龄健康雄性SD大鼠20只，体重200~220 g(购自宁夏医科大学实验动物中心)。大鼠禁食12 h后，抽取尾静脉血测定空腹血糖，将20只血糖正常的大鼠随机分为正常对照组和糖尿病组，糖尿病组大鼠按照60 mg·kg^-1的剂量采用一次性腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病模型，正常对照组大鼠注射等量的溶剂。3 d 后尾静脉采血检测血糖，空腹血糖≥ 16.7 mmol·L^-1为糖尿病造模成功，每隔2周检测大鼠体重和血糖。本实验通过宁夏医科大学医学实验动物伦理委员会审查并获批准（伦理批准号：IACUC-NYLAC-2021-115）。
1.3　彩色多普勒超声检测大鼠视网膜中央动脉的血流参数
造模后12周，使用异氟烷吸入麻醉剂麻醉大鼠，固定大鼠四肢并且对大鼠眼部周围进行脱毛，将超声耦合剂均匀涂抹在眼部，探头放至耦合剂表面进行探查，检测大鼠视网膜中央动脉(CRA)的收缩期峰值流速(PSV)和舒张末期流速(EDV)，并计算阻力指数(RI)、搏动指数(PI)。
1.4　HE染色观察大鼠视网膜组织病理学变化
造模后12周，用10 g·L^-1戊巴比妥钠注射液 (5 mL·kg^-1) 右下腹腔注射麻醉大鼠，腹主静脉采血后，取出眼球并放入装有眼球固定液的离心管中进行固定，脱水，石蜡包埋，切片，苏木素染色5 min，清洗，伊红染色20 min，脱水，封片，在光学显微镜下观察视网膜组织的病理学形态。
1.5　免疫组织化学染色观察大鼠视网膜中GLUT1/4的表达情况
将石蜡切片放入60 ℃烤片机中烤20 min，脱蜡水化，置于修复液中煮沸后冷却至室温，用PBS清洗，H₂O₂阻断15 min，封闭20 min后孵育一抗 (GLUT1 1∶5 000,GLUT4 1∶300)，4 ℃过夜，PBS清洗3次，37 ℃避光孵育辣根过氧化物酶标记的二抗 (1∶5 000) 1 h，再用PBS清洗后，加入DAB显色，滴加苏木素，脱水，封片，在光学显微镜下观察大鼠视网膜中GLUT1/4的表达情况。
1.6　Western blot检测大鼠视网膜GLUT1/4和Sirtuins蛋白的表达情况
将眼球沿着角巩膜缘剪开，取出视网膜后置于裂解液中，用研钵充分粉碎组织。离心，取上清。通过BCA试剂盒检测样本蛋白浓度，将蛋白通过 SDS-PAGE分离后转印到PVDF膜上，用100 g·L^-1的脱脂牛奶封闭2 h后孵育一抗 (β-actin 1∶5 000,SIRT1-7 1∶1 000,GLUT1 1∶4 000,GLUT4 1∶2 000)。放摇床中4 ℃孵育过夜。次日，用TBST洗膜后孵育二抗 (1∶5 000)，配置ECL发光液，在凝胶成像系统曝光，检测灰度值，计算GLUT1/4和Sirtuins蛋白相对表达量。
1.7　qRT-PCR检测大鼠视网膜中Sirtuins mRNA的表达水平
采用Trizol一步法提取视网膜总RNA，逆转录后从GenBank获得目的基因mRNA的全长序列，利用Primer 5.0设计引物序列，Sirtuins及β-actin的引物序列见表1。采用qRT-PCR检测大鼠视网膜中Sirtuins mRNA的表达水平。


1.8　统计学方法
采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，使用Graphpad Pism 9.5制图。计量资料以均数±标准差表示，采用独立样本t检验进行分析。检验水准：α=0.05。
2　结果　
2.1　两组大鼠体重和血糖的变化
与正常对照组相比，糖尿病组大鼠均出现多饮、多食、多尿、体重减轻等症状。造模8周后糖尿病组大鼠体重显著低于正常对照组(均为P<0.05);链脲佐菌素注射2周后，糖尿病组大鼠血糖显著高于正常对照组 (均为P<0.05) (图1)。



2.2　两组大鼠CRA的血流参数
造模后12周，与正常对照组相比，糖尿病组大鼠CRA的PSV和EDV均显著降低 (均为P<0.001)；RI与PI无明显改变(均为P>0.05) (表2)。


2.3　两组大鼠视网膜HE染色结果
HE染色结果显示，正常对照组大鼠视网膜组织各层结构清晰，细胞排列紧密、规则，未发现明显的病理改变；糖尿病组大鼠视网膜组织厚度变薄，各层界限模糊，结构紊乱，细胞数量减少 (图2)。



2.4　两组大鼠视网膜中GLUT1/4的表达情况
免疫组织化学染色结果显示，在大鼠视网膜中GLUT1主要位于视网膜色素上皮层，GLUT4位于神经节细胞层、内丛状层及光感受器层；与正常对照组相比，糖尿病组大鼠视网膜中GLUT1及GLUT4的表达减少(图3A)；Western blot检测结果也表明，糖尿病组大鼠视网膜中GLUT1 及GLUT4蛋白相对表达量均低于正常对照组(均为P<0.05) (图3B，表3)。
2.5　两组大鼠视网膜中Sirtuins 蛋白表达情况
Western blot检测结果显示，糖尿病组大鼠视网膜中SIRT1-SIRT7蛋白相对表达量均低于正常对照组(均为P<0.05)(表4)。





2.6　两组大鼠视网膜中Sirtuins mRNA的表达情况
qRT-PCR检测结果显示，与正常对照组相比，糖尿病组大鼠视网膜中的SIRT1-SIRT7 mRNA相对表达量均下降，差异均有统计学意义(均为P<0.01)(表5)。





3　讨论
目前,我国糖尿病的发病率为13%，DR作为糖尿病患者最常见的眼部并发症，其发病率约占糖尿病患者总数的40%，是导致成人视力丧失的主要原因，预计到2030年全球DR患者数可能达到1.91亿^［6-8］。DR的发病机制复杂，现有的临床治疗手段无法有效控制病情。因此，探索DR的发病机制，寻找预防及治疗DR安全且有效的方法具有重要的现实意义。
DR的主要病理改变包括视网膜缺血、血管渗透性增加和神经元异常等。本研究显示，糖尿病组大鼠CRA的PSV和EDV均下降，说明视网膜血流速度下降，供血减少。病理组织学结果显示，糖尿病大鼠视网膜组织各层变薄、结构紊乱、细胞大量丢失，表明糖尿病大鼠视网膜功能和结构发生紊乱。GLUT是一类跨膜蛋白，可转运葡萄糖进入细胞内，根据其序列相似性和底物亲和力可将GLUT分为三类:I类GLUTs (1-4、14) 可促进葡萄糖的摄取，II 类 GLUT(5、7、9、11)是果糖转运蛋白，III 类 GLUT (6、8、10、12、13)是结构上非典型成员^［9］。GLUT1是一类广泛分布于各个组织器官的葡萄糖转运体，是葡萄糖通过血-视网膜屏障的载体，主要定位于视网膜血管内皮细胞和色素上皮细胞层，是维持视网膜葡萄糖供给平衡的重要因素，在高糖环境中视网膜细胞GLUT1出现异常，将会导致视网膜的糖代谢紊乱^［10］。GLUT4是骨骼肌和脂肪组织中最主要的葡萄糖转运载体，在胰岛素刺激下，GLUT4通过将葡萄糖由细胞外转位至细胞中，而发挥降血糖的作用。有研究表明，上调GLUT4可改善高糖合并缺血缺氧心肌细胞的糖代谢异常状态^［11］。本研究结果显示糖尿病大鼠视网膜组织GLUT1和GLUT4蛋白表达水平下降。
Sirtuins是一类具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性去乙酰酶活性的蛋白质，主要与DNA修复、细胞周期、代谢和衰老的调节有关，该家族由7种亚型组成，其中SIRT1和SIRT2位于细胞核及细胞质中。研究表明，白内障、青光眼和DR等眼部病变都与SIRT1的表达有关，SIRT1可通过调节细胞凋亡、炎症和氧化应激改善DR^［12］；SIRT2可通过调节胰岛素的作用来改善细胞状态，下调SIRT2会加重胰岛素抵抗^［13］；SIRT3、SIRT4和SIRT5主要位于线粒体基质中，SIRT3可通过抑制血管内皮生长因子表达及促进细胞自噬从而预防DR^［14］；SIRT4是维持胰岛素分泌和葡萄糖稳态的关键参与者^［15］；SIRT5可通过对视神经磷酸酶去琥珀酰化保护视网膜神经节细胞免受DR引起的损伤^［16］；SIRT6定位于细胞核，可抑制血管内皮生长因子表达，改善DR小鼠的炎症反应、氧化应激且能缓解视网膜细胞凋亡^［17-18］；SIRT7主要位于核仁中，可通过p53去乙酰化抑制细胞凋亡和缓解miR-335-5p诱导的内皮细胞功能障碍^［19-20］。本研究结果显示糖尿病大鼠视网膜组织中SIRT1-SIRT7蛋白及mRNA均呈低表达状态，提示Sirtuins在DR中可能发挥正向调控的作用。
4　结论
糖尿病可引起大鼠视网膜组织中GLUT1/4和Sirtuins的表达发生改变，GLUT1/4和Sirtuins可能参与了DR的发生与发展。